为方便广大同行交流，公众号近期将陆续推出有关RNA互作分子研究技术的系列文章，本期将介绍最常见的实验技术：RIP。RIP（RNA Immunoprecipitation）是研究RNA-蛋白相互作用的重要实验，主要是通过抗蛋白的抗体进行免疫共沉淀，然后分析相互作用的RNA分子。有关RIP的实验技术方法文章挺多的，研究论文就更多了，这也说明RIP实验的重要性。下面我们主要参考一篇方法学的文章，详细分析RIP实验的原理和操作方法。该文章是2016年9月23日发表于Methods in Molecular Biology杂志的一篇方法学文章，通讯作者为意大利”ABT”- CNR遗传与生物物理研究所的Maria R. Matarazzo教授[1]。
材料与试剂准备：
（所有试剂均需用超纯水配制，试剂纯度级别不低于分析纯）
PBS (pH7.4)；
10×多聚体裂解液：1000 mM KCl, 50 mM MgCl2 , 100 mM HEPES-NaOH pH 7, 5% NP-40。室温放置，使用前用超纯水稀释至1×并添加1 mM DTT， 200 units/ml RNase OUT，EDTA-free 蛋白酶抑制剂Cocktail。
5×NT-2 buffer：250 mM Tris-HCl(pH7.4), 750 mM NaCl，5 mM MgCl2，0.25% NP-40。 4 °C保存，
NET-2 buffer：用超纯水将NT-2 buffer稀释至1×，并添加20 mM EDTA (pH 8.0), 1 mM DTT, 200 units/ml RNase OUT。
甲醛溶液：50 mM HEPES-KOH, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 11 % 甲醛。
细胞裂解液：10 mM Tris-HCl (pH 7.4)，10 mM NaCl, 0.5 % NP-40。用时补加1mM DTT, 200 units/ml RNase OUT，EDTA-free 蛋白酶抑制剂Cocktail。
核重悬Buffer：50 mM HEPES-NaOH (pH 7), 10 mM MgCl2。用前添加1mM DTT, 200 units/ml RNase OUT，EDTA-free 蛋白酶抑制剂Cocktail。
IP Buffer：150 mM NaCl, 10 mM Tris–HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (pH 8), 1 % Triton X-100, 0.5 % NP-40。用前添加1mM DTT, 200 units/ml RNase OUT，EDTA-free 蛋白酶抑制剂Cocktail。
蛋白酶K消化Buffer：1× NT-2 buffer 添加1 % SDS, 1.2 mg/ml Proteinase K。
操作流程：
图1 RIP实验操作流程 （来自[1]）
常规RIP实验：
裂解物准备：
1) 细胞生长至90%覆盖度，细胞计数，满足最终获得2~5mg蛋白样品的数量，约5~20 × 10 6 细胞总数；
2) 1000 ×g，4 °C离心5min，弃上清；
3) 用1× 预冷PBS洗两遍，弃上清；
4) 用等体积的1×多聚体裂解液重悬细胞，轻轻吹散，冰浴5min；
5) −80 °C冻存促进细胞裂解，样品也可以在−80 °C放置数月。
磁珠与抗体准备：
1) protein-A/G包被的磁珠充分重悬，取75μl 至1.5 ml EP管中；
2) NT-2 buffer洗涤两次；
3) 用100 μl NT-2 buffer重悬，加目标抗体5μg，室温混匀1h；
4) 5000 × g离心 15 秒，加磁座吸附磁珠，上清用真空泵吸走；
5) 从磁座上取下管子，加1ml NT-2，吹打混匀，5000 × g离心 15 秒，重复5次。（总共洗磁珠6次）；
6) 900μl NET-2 buffer 重悬磁珠，冰浴备用。
常规RIP：
1) 将存放在-80 °C的细胞裂解物20000 × g，4 °C离心10 min；
2) 取100μl上清至制备好的900μl NET-2 buffer 重悬的磁珠中，进行抗体孵育，每个体系的体积为1ml；
3) 取出10μl的样品作为“Input”备份，−80 °C保存备用；
4) 垂直混合器4 °C混合3小时以上或过夜；
5) 短暂离心将样品甩到管底，冰浴中将样品放到磁座上，放置1min后弃上清；
6) 加1ml NT-2，强力震荡混匀；
7) 短暂离心将样品甩到管底，冰浴中将样品放到磁座上，放置1min后弃上清，重复5次；
8) 沉淀即为RIP实验获得的样品，可进一步通过蛋白酶K消化后提取RNA进行后续分析。
甲醛交联RIP实验：
裂解物准备：
1) 细胞生长至90%覆盖度，细胞计数，满足最终获得2~5mg蛋白样品的数量，约5~20 × 10 6 细胞总数；
2) 向细胞悬液中加入适量的甲醛溶液，甲醛终浓度达到1%，室温放置10min；
3) 向交联体系中加10倍体积的2.66 M甘氨酸，室温放置5min，冰浴10min；
4) 用1× 预冷PBS洗两遍，弃上清；
5) 用4ml细胞裂解液重悬，冰浴裂解10-15min；
6) Dounce匀浆器的A杵匀浆10次，B杵匀浆40次；
7) 1000g，4°C离心10min收集细胞核；
8) 用3ml核重悬Buffer重悬，超声处理至DNA长度在1000~200bp范围；
9) 加入250 unites/ml的DNase，37 °C孵育30min；
10) 加入20 mM EDTA终止DNase；
11) 样品重悬后通过添加相应试剂将Triton X-100浓度调至1%,脱氧胆酸钠浓度调至0.1 %, SDS浓度调至0.01 %，NaCl浓度调至140 mM，备用。
磁珠与抗体准备：
1) protein-A/G包被的磁珠充分重悬；
2) 取75μl 至1.5 ml EP管中，用0.5ml核重悬Buffer（添加1 % Triton X-100, 0.1 % 脱氧胆酸钠，0.01 % SDS和 140 mM NaCl）
3) 用100 μl核重悬Buffer重悬磁珠，加5μg抗体或阴性对照，室温混匀1h；
4) 5000 × g 离心for 15 s，管子放到磁座上，弃上清；
5) 加1ml核重悬Buffer，吹打混匀，5000 × g 离心for 15 s，放到磁座上，弃上清，重复5次（总共洗6次）；
6) 用75μl核重悬Buffer重悬，冰浴备用。
交联RIP：
1) 将细胞裂解物20000 × g，4 °C离心10 min，吸取925μl体积的上清液至包被好抗体的磁珠中，终体积为1ml；
2) 取出9.7μl的样品作为“Input”备份，−80 °C保存备用；
3) 垂直混合器4 °C混合3小时以上或过夜；
4) 短暂离心将样品甩到管底，冰浴中将样品放到磁座上，放置1min后弃上清；
5) 加1ml 预冷的IP Buffer，强力震荡混匀；
6) 短暂离心将样品甩到管底，冰浴中将样品放到磁座上，放置1min后弃上清，重复5次；
7) 沉淀即为RIP实验获得的样品，可进一步通过蛋白酶K消化后提取RNA进行后续分析。
RNA制备：
1) 将RIP获得的样品加150 μl蛋白酶K Buffer，每个“Input”添加107μl of NT-2, 15 μl 10 %SDS,18 μl 蛋白酶K，总体积达到150 μl。55 °C孵育30min；
2) 短暂离心将液体甩至管底。放置到磁座，上清转移至新的EP管中，加250 μl NT-2；
3) 分别加入400μl 酚:氯仿:异戊醇(125:24:1)，剧烈震荡15S，20000 × g 室温离心 10 min；
4) 小心吸取350 μl上清，注意不要碰到沉淀层，上清转移至新的EP管中，加400μl氯仿，震荡15s，20,000 × g 室温离心 10 min；
5) 小心吸取300 μl水相至新的EP管中，加50μl 5M的乙酸铵，15μl 7.5 M LiCl，5μl 的5 mg/ml糖原，850 μl无水乙醇；
6) −80 °C放置1h或过夜，20000 × g，4 °C 离心30 min，小心弃上清；
7) 500 μl预冷的80%乙醇洗涤沉淀，20000 × g ，4 °C离心15 min；
8) 样品晾干，用10~20 μl 的RNase-free水溶解RNA样品。可以增加DNase处理步骤以排除DNA污染造成的干扰。
9) 所收取的RNA样品可直接用于反转录鉴定，QPCR，microarray，测序等后续研究。
注意事项：
1. 所有的实验用品均需保证无DNase和RNase，操作台面和移液枪等实验用品保证绝对干净；
2. 细胞裂解过程中适当震荡有利于细胞充分裂解；
3. IP用磁珠的选择要严格遵照说明书。一般小鼠来源的抗体与Protein G结合力较强，兔来源的抗体与蛋白A/G结合力均较强；
4. 磁座吸附磁珠的时候要注意注意磁珠需完全附着在管壁，弃上清的过程要注意更换枪头；
5. 存在于NET-2的EDTA能降低核糖体RNA与核糖体蛋白的结合，需要注意实验的需要；
6. Input对照可用于QPCR的标准曲线。更严谨的设计里还需要有非特异性结合RNA的对照，需要慎重的选择合适非目标蛋白进行非特异性结合的对照，如果是非RNA结合蛋白有可能会大大降低非特异性结合RNA的能力，并不是最佳的非特异性RNA结合对照。
7. IP效率需要要通过Western实验验证，因此需要准备更多量的input对照；
8. 为了提高交联的效率，在收集完细胞并计数后最好用预冷PBS洗涤两次，甲醛交联的反应也最好在预冷PBS溶液中进行。甲醛交联的时间非常重要，太短了会造成假阴性，太长了则造成假阳性。需要设计实验逐渐摸索条件。
9. 超声处理的条件也非常关键。超声处理的效果受到细胞类型，细胞密度与数量等条件的影响。超声处理中需要冰浴以减少蛋白变性的可能，超声的强度宜选择中等强度条件，分多次脉冲式处理更好。
参考文献：
1. Gagliardi, M. and M.R. Matarazzo, RIP: RNA Immunoprecipitation. Methods Mol Biol, 2016. 1480: p. 73-86.
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