抗体还能沉淀出RNA，没想到吧！（蛋白-RNA）--RIP实验解析

一、RNA结合蛋白

RNA结合蛋白是一类伴随RNA的调控代谢过程，与RNA结合的蛋白质的总称。

二、RNA与蛋白结合方式

3种结合方式：

三、RIP 概念

RIP是一种利用免疫共沉淀技术，分离与蛋白结合的所有RNA，从而研究RNA与蛋白互作的技术。

四、RIP 的原理

实验原理如下：

五、RIP 实验流程

1、细胞培养足量，使细胞浓度达105个/ml以上。

2、取部分细胞液加入细胞裂解液，裂解细胞。

3、取部分细胞裂解液提取蛋白，加入抗体验证抗体。

4、另取部分裂解液加入抗体，4度过夜孵育。

5、加入protein A/G球珠，吸附RNA-蛋白复合体。

6、磁珠吸附并沉淀抗体-蛋白质-RNA复合体。

7、RNA-蛋白复合体洗脱，蛋白酶K重悬磁珠。

8、RNAs纯化，质量检测，反转录及后续分析。

六、RIP 结果

RIP 结果分析1

RIP 结果分析2

七、RIP 实验应用

1、探究细胞核RNA-蛋白互作，细胞质RNA-蛋白质互作，在疾病模型中调控机制。

①细胞核RNA-蛋白互作

②细胞质RNA-蛋白互作

2、探究 miRNA-mRNA，lncRNA-mRNA, lncRNA-DNA等分子间相互调控作用机制。

3、RNA pull down

RNA Pull down技术，是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。

八、RIP 实验特点

1、需确定目的蛋白，并验证目的蛋白表达情况。

2、设计合适抗体，抗体需预先稀释，并验证抗体质量。

3、加入蛋白酶抑制剂，磁珠预冷，减少蛋白质降解。

九、RIP 注意事项

1、防止非特异性的RNA的结合

RIP技术反应体系中需防止非特异性的RNA的结合，同时加入蛋白酶K，防止RNA-蛋白复合物破坏。

2、操作过程中试剂无RNA酶污染

RIP技术反应体系中的试剂和抗体需无RNA酶污染,同时抑制内源性RNA酶活性，防止RNA降解。