Review
Appl Environ Microbiol
. 2021 Aug 26;87(18):e0054421.
doi: 10.1128/AEM.00544-21. Epub 2021 Aug 26.
Forty Years of Oxalobacter formigenes, a Gutsy Oxalate-Degrading Specialist
Steven L Daniel 1, Luke Moradi 2, Henry Paiste 2, Kyle D Wood 3, Dean G Assimos 3, Ross P Holmes 3, Lama Nazzal 4, Marguerite Hatch 5, John Knight 3
Affiliations expand
PMID: 34190610
PMCID: PMC8388816
DOI: 10.1128/AEM.00544-21
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Oxalobacter formigenes是一种独特的厌氧细菌，仅依赖草酸盐生长，是哺乳动物肠道中一种关键的草酸盐降解细菌。O. formigenes对肠道中草酸盐的降解在预防以富含草酸盐植物为食的动物的肾毒性方面发挥着关键作用。O. formigenes在降低人类草酸钙肾结石病和草酸肾病风险方面的作用尚不清楚，部分原因是培养这种生物体的困难以及缺乏使用控制草酸含量的饮食的研究. 在此，我们回顾了关于发现O. formigenes 40 周年的文献，重点关注其生物学、其在肠道草酸盐代谢和草酸钙肾结石疾病中的作用，以及未来研究的潜在领域。还讨论了在健康志愿者和原发性高草酸尿症 1 型 (PH1)（一种罕见但严重的草酸钙肾结石疾病形式）患者中利用O. formigenes进行的临床试验的结果。已经整合了有关O. formigenes菌株和培养这种细菌的最佳实践的信息，这应该成为研究人员的良好资源。
关键词:草酸盐降解,产酸草酸杆菌, 肠道微生物组, 肾结石病, 益生菌, 培养方法
1940 年代和 1950 年代的研究表明，草酸盐会被人类粪便和瘤胃中的微生物降解，尽管对负责这种活动的微生物的性质知之甚少 ( 1 , 2 )。草酸盐是一种常见于人类食用的植物（例如大黄、菠菜和甜菜）和反刍动物食用的各种草料植物（例如Halogeton glomeratus ）中的化合物 ( 3 )。当大量摄入草酸盐时，会因草酸钙晶体在肾脏中的形成和沉积而发生肾毒性。图 1A）。当绵羊在富含草酸盐植物的田地放牧后死亡时，这个问题首先被提出来（图 1B) ( 4 )。尽管钙补充剂被用来减少放牧动物的急性草酸盐毒性 ( 5 )，但最成功的方法是通过逐渐适应高草酸盐摄入量 ( 6 )。另据报道，季节性进食模式会影响这些动物瘤胃中细菌对草酸盐的降解，并且在富含草酸盐的植物占主导地位的放牧作物的季节中，草酸盐的降解程度最高（7）。最初的假设是草酸盐降解生物在富含草酸盐的植物上共生，并在牲畜吃草时被摄入（7)，但后来被 Allison 及其同事拒绝，他们证明选择常驻的草酸盐降解细菌，而不是引入新物种，是导致草酸盐降解率和草酸盐降解细菌数量增加的原因。瘤胃 ( 8 , 9 )。考虑到瘤胃的严格厌氧条件，Allison 及其同事假设严格的厌氧菌是瘤胃草酸盐降解的主要原因，并且在 1980 年，Karl Dawson 从绵羊瘤胃中分离出一种厌氧草酸盐降解细菌。图 2A) ( 10 )。1985 年，Milton Allison 及其同事从人类粪便中分离出同样的细菌。图 2B) 并命名为Oxalobacter formigenes ( 11 )。重要的是，这是在人类肠道中首次发现完全依赖草酸盐的共生专性厌氧菌。因此，这种有益的肠道细菌在草酸盐利用方面被认为是“专家”，而“通才”可以使用包括草酸盐在内的多种底物。自从其分离以来，许多研究已经检查了O. formigenes定植对肠道草酸盐水平、尿中草酸盐排泄和草酸盐在哺乳动物肠道中的运输的影响 ( 12 , – 14 )。
图。1
（A）草酸盐喂养的实验室大鼠（RC Cutlip 和 SL Daniel，未发表的数据）肾组织染色薄片中的草酸盐晶体（箭头表示存在的一些晶体）。(B) 由于食用草酸含量高的植物Halogeton glomeratus引起的草酸中毒导致的死羊 (>1,200) （从参考文献101重印）。
图2
Karl A. Dawson (A) 和 Milton J. Allison (B)，这两位微生物学家负责分离和命名可降解草酸盐的肠道细菌Oxalobacter formigenes。Dawson 博士（奥特奇副总裁兼首席科学官，现已退休）在 2014 年奥特奇第 30 届年度国际研讨会上发表讲话。Allison 博士于 2018 年在爱荷华州立大学的实验室中发表讲话。
O. formigenes是革兰氏阴性、专性厌氧、杆状或曲线形、不运动、不形成孢子的细菌。图 3) 已分配给以下分类群：细菌（域）；变形菌门（门）；Betaproteobacteria（类）；Burkholderiales（订单）；草酸杆菌科（科）；草酸杆菌（属）；甲醛（种）；和 OxB（型菌株）。表格1列出了迄今为止分离的各种O. formigenes菌株的详细信息。比较 17 种O. formigenes菌株的细胞脂肪酸谱，包括从人类、绵羊、牛、猪、豚鼠和大鼠（野生和实验室）的胃肠内容物以及淡水湖沉积物中分离的菌株，支持将这些菌株分为两个主要组（目前指定为第 I 组和第 II 组）的概念。在第一组菌株中，环状 17 碳脂肪酸占优势，而在第二组菌株中，环状 19 碳脂肪酸占优势（11 , 15）。此外，基于细胞蛋白、血清学测试、16S rRNA 序列和针对oxc基因的寡核苷酸探针/引物的特异性（11 , 15 , – 17 )。迄今为止，唯一的例外似乎是菌株 OxGP1（从豚鼠盲肠中分离），根据细胞脂肪酸和oxc基因分析属于第二组，根据 rRNA 序列比较属于第一组（图 4) ( 16 )。有趣的是，另一种菌株 HOxBLS（II 组成员）在基于 16S rRNA 的系统发育树中位于 I 组和 II 组之间。图 4）。总体而言，II 组菌株似乎比 I 组菌株更多样化，这导致了 Sidhu 等人的建议。II 组菌株可进一步分为 3 个亚组 ( 17 )。这种菌株的分组/亚组相对于O. formigenes意味着什么其生态学、营养学和生理学、抗生素敏感性、人类定植以及对尿草酸盐和肾结石预防的影响（仅举几例）目前尚不清楚，值得进一步研究。值得注意的是，II 组菌株通常更难以在肉汤培养中维持，并且无法达到与 I 组菌株相同的最终光密度（未发表的观察结果）。因此，在处理 II 组菌株时，应提供充足的冷冻甘油储备用于培养物恢复。
图 3
(A) 产酸草酸杆菌菌株 OxWR1 的电子显微照片（从参考文献102重印）。(B)产酸草酸杆菌 HOxBLS菌株的革兰氏染色（N. Pareek 和 SL Daniel，未发表的数据；×1,000 放大倍数）具有典型的不同形态和大小。
图 4
基于从美国国家生物技术信息中心 (NCBI) 获得的 16S rRNA 序列，对产草酸杆菌 I 组和 II 组菌株以及 Herbaspirillum seropedicae 菌株 Z67（外群和 Betaproteobacteria 类的成员）进行系统发育分析。GenBank 登录号与菌株名称一起显示。进化历史和距离分别使用邻接法（103）和最大复合似然法（104）计算。以 1,000 次重复的百分比表示的引导值显示在树中的每个内部节点旁边 ( 105）。比例尺代表每个碱基的替换数量的估计值。进化分析在分子进化遗传学分析（MEGA）（106）中进行。
在厌氧条件下，在 pH 6 和 7 之间以及在含有矿物质、草酸盐、乙酸盐和少量酵母提取物的 CO 2 -碳酸氢盐缓冲的不确定培养基中， O. formigenes在培养中的最佳生长发生。表 2）。酵母提取物虽然不是必需的，但似乎确实可以改善某些产霉菌株的生长，尤其是在最初从肠道分离时。然而，无论是否存在酵母提取物，都会添加低浓度（0.5 至 2 mM）的乙酸盐，因为O. formigenes会从乙酸盐和二氧化碳中同化少量碳，用于合成细胞生物质(图 5）。单独的醋酸盐不支持这种有机体的生长；事实上，迄今为止测试的 60 多种不同的化合物中没有一种被发现对O的生长有促进作用。甲醛（11、18、19）。_ _ _ 即使是富集的复合培养基（例如，厌氧蛋白胨酵母葡萄糖或脑心浸液）也不能支持产霉菌的生长，因此经常接种以帮助确定产霉菌培养物的纯度 ( 18 )。
图 5产酸草酸杆菌草酸盐代谢示意图。
用于富集和常规培养产氧草酸杆菌的厌氧草酸盐肉汤
| 组分a和制剂b | 每升水量（最终浓度） |
|---|---|
| 去离子水 | 1,000 毫升 |
| 草酸钾一水合物 | 3.7 克（20 毫米） |
| 酵母抽提物 | 1.0 克 (0.1%) |
| 矿物溶液c | 50.0 毫升 |
| 乙酸钠·三水合物 (0.4 M) | 5.0 毫升（2 毫米） |
| 微量金属溶液d | 2.0毫升 |
| 刃天青 (0.1%) | 1.0 毫升 |
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a按上述顺序将组分加入锥形瓶中；如果需要确定的培养基，酵母提取物可以省略。为安全起见，烧瓶的体积应为所制备培养基体积的两倍。总体积大于 1 升，以考虑沸腾过程中损失的水。
b将 pH 值调至 7，加入碳酸氢钠（每升 7.5 克），在加热板上将培养基煮沸，同时通入 CO 2。在培养基中的刃天青（O/R 指示剂）从蓝色变为粉红色（沸腾约 5 到 10 分钟）后，使用高压灭菌手套小心地将烧瓶从热源中取出，继续用 CO 2起泡，然后将培养基冷却至室温冰浴。加入还原剂半胱氨酸·HCl·H 2 O（0.5 g/L），混合并用CO 2冲洗顶部空间，直到培养基被还原（无色）。将 10 毫升等分试样分装到培养管（18 x 150 毫米；2048 系列 [Bellco 玻璃]；约 27.2 毫升带塞体积）中，用温和的 CO 2流冲洗。用 CO 2冲洗顶空5 秒，然后用灰色丁基橡胶塞塞住并用铝压接密封圈密封。当管被密封时，充气套管应放置在下一个空管中，以便在添加培养基之前进行冲洗。逐管重复处理，直到分配完整个培养基。在 121°C 高压灭菌 15 分钟并快速排气。高压灭菌后，培养基的 pH 值为 6.6 至 6.8。
c矿物溶液含有（克/升）：KCl，20；NH 4 Cl, 10; KH 2 PO 4 , 10; 和 MgSO 4 ·7H 2 O, 1 （一次溶解一个并在 4°C 下储存溶液）。
d微量金属溶液含有（克/升）：次氮基三乙酸三钠，1.500；MnSO 4 ·H 2 O，0.500；FeSO 4 ·7H 2 O，0.100；CO(NO 3 ) 2 ·6H 2 O, 0.100; ZnCl 2 , 0.100; NiCl 2 ·6H 2 O，0.050；H 2 SeO 3, 0.050; CuSO 4 ·5H 2 O, 0.010; AlK(SO 4 ) 2 ·12H 2 O, 0.010; H 3 BO 3 , 0.010; Na 2 MoO 4 ·2H 20.010；Na 2 WO 4 ·2H 2 O，0.010（一次溶解1个，4℃保存溶液）。
O. formigenes的标志性特征之一是它对草酸盐的绝对需求，既是产生能量的底物，也是生长的主要碳源。图 5) ( 20 , – 22 )。鉴于草酸盐的高度氧化状态，能量产量很低，但足以支持生长。草酸盐代谢的产物是二氧化碳和甲酸盐，每 mol 草酸盐代谢产生大约 1 mol。能量守恒的中心是通过草酸（输入）和甲酸（输出）在细胞膜上的电交换产生质子动力，以及当草酸的 CoA-酯被消耗时细胞内质子的消耗。被草酰辅酶A脱羧酶脱羧 ( 23 , 24 )。质子消耗最终导致外部环境碱化。
大多数（如果不是全部）中列出的菌株表格1使用 Hungate ( 25 , – 27 ) 和培养基 (表 2) 由 Dawson 和其他人在 1980 年代从绵羊瘤胃中分离出O. formigenes菌株 OxB 后开发的 ( 10 )。一种这样的新方法是使用含有草酸钙的厌氧卷管，其中可以根据菌落周围透明区域的形成来检测厌氧草酸降解细菌（例如，甲醛）的菌落。图 6; 看表3用于制备厌氧草酸钙卷管和板）。多年来，这种方法已成功用于从肠道和环境样品中分离（有或没有预先富集）、计数和表征O. formigenes菌株（16、28）。
图 6
在厌氧卷管（A 和 B）和含有草酸钙的厌氧板（C）中孵育后，产酸草酸杆菌在菌落周围形成透明区域。看表3用于在管和板中制备厌氧草酸钙琼脂。
| 组分a和卷管b和板c的制备 | 每升水量（最终浓度） |
|---|---|
| 去离子水 | 750 毫升 |
| 草酸钾一水合物 | 3.7 克（20 毫米） |
| 酵母抽提物 | 1.0 克 (0.1%) |
| 矿物溶液（见表 2) | 50.0 毫升 |
| 乙酸钠·三水合物 (0.4 M) | 5.0 毫升（2 毫米） |
| 微量金属溶液（见表 2) | 2.0毫升 |
| 1% CaCl 2 ·2H 2 O (147.0 g/mol; 68 mM) 溶液 | 200.00 毫升（14 毫米） |
| 半胱氨酸·HCl·H 2 O (175.61 g/mol) | 0.5 克（3.4 毫米） |
| 碳酸氢钠 (84.01 g/mol) | 7.5 克（89.3 毫米） |
| 琼脂 | 17.5 克 (1.5%) |
| 刃天青 (0.1%) | 1.0 毫升 |
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a按指示顺序将上述所有组分加入带搅拌棒的 2 升锥形烧瓶中；为安全起见，烧瓶体积应为所制备培养基体积的两倍。
b厌氧卷管 (图 6)：搅拌混合并在加热板上将培养基煮沸，同时用 CO 2起泡。继续煮沸培养基，直到琼脂融化。一旦琼脂融化，继续用 CO 2使培养基起泡，并使用高压灭菌手套小心地将烧瓶从热源中取出，将烧瓶转移到装有热水 (~50°C) 的绝缘桶中。热水桶应放在一个小的搅拌板上，以便在分配时可以搅拌介质。重要的是在分配时保持草酸钙悬浮。搅拌并继续向培养基中加入 CO 2并让培养基冷却约 5 分钟。将 7 ml 分配到 18 × 150-mm 卷边封口培养管中，该培养管正按照中所述的程序用 CO 2冲洗表 2. 在 121°C 高压灭菌 15 分钟并快速排气。高压灭菌后，培养基的 pH 值为 6.6 至 6.8。如果当天使用培养基，请将试管置于水浴 (~48°C) 中进行回火。回火后，通过无菌针头和注射器将样品（接种物）添加到试管中；接种后，通过颠倒试管数次将接种物轻轻混合到培养基中，然后将试管侧放在冰上（装在不加水的冰桶中），快速旋转试管，使琼脂在试管内壁上凝固。如果当天没有使用琼脂培养基，请将培养基储存在室温下，并在需要时重新加热以融化琼脂。将接种过的试管放入培养箱后，冷凝水（水）将在试管底部积聚。保持接种卷管直立，以防止底部的水污染菌落。
c厌氧板 (图 6)：使用与上述相同的组件，但有以下修改：在 1 升烧瓶中制备 500 ml 培养基；制备中省略了碳酸氢钠和CO 2 ；高压灭菌前将培养基pH调至6.6~6.8；高压灭菌后，将缓和的琼脂培养基（~20 ml；如果平板含有薄薄的琼脂培养基，则更容易检测透明区域）将其倒入实验室工作台上的无菌培养皿中，待琼脂凝固后，将平板转移到厌氧培养皿中室（90% N 2 /5% CO 2 /5% H 2）并在使用（例如，划线）和在室中温育之前允许脱气过夜。
这种细菌的独特特征可能因菌株而异，可能会影响其配制成益生菌制剂的能力。最近的一项研究检查了与益生菌菌株生产相关的一些常见过程和条件，强调了 I O. formigenes菌株 OxCC13 对酸奶中冻干和储存的适应能力 ( 29 )。也许人类可能能够以冻干形式或混合在酸奶中的有利菌株定植。
O. formigenes的基因组 ( 13 , 30 , – 32 ) 和蛋白质组 ( 33 ) 的可用性为增加我们对这种有益肠道细菌的重要生物学特性的理解提供了机会，包括识别重要的蛋白质和促进宿主来源的草酸盐的定植弹性、耐气性和肠道分泌。对两种O. formigenes菌株的基因组序列的回顾发现了一些有趣的差异，这可能表明 I 组和 II 组菌株利用不同的途径在肠道内生存和繁衍 ( 13 )。
O. formigenes基因组的一般特征显示在表 4. 目前，只有 4 个培养的O. formigenes菌株（I 组菌株 HC-1 和 OxCC13、推定的 I 组菌株 SYGSS-15 和 II 组菌株 HOxBLS）具有公开可用的测序基因组（13、30、- 32 )。相比之下，来自常驻肠道厌氧菌普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus ）和胃病原体幽门螺杆菌的培养菌株的测序基因组分别超过 50 和 500 个。尽管数据集有限，但很明显，O. formigenes HC-1 和 HOxBLS 的基因组（表 4)，以及针对 OxCC13 ( 31 ) 和 SYGSS-15 ( 30 ) 报告的那些都很小，大小约为 2.5 Mb。相比之下，Escherichia coli Nissle 1917 是一种经过充分研究的革兰氏阴性肠道益生菌（商品名为 Mutaflor），其基因组约为 5.4 Mb ( 34 , 35 )。原核基因组大小范围从 0.5 到远远超过 10 Mb，表明O. formigenes基因组更接近基因组大小尺度的较低（较小）端。高等人。最近报道，与原核生物基因组相关的 CRISPR 系统和病毒（噬菌体）的组合似乎阻碍了基因组的扩展，因此随着时间的推移会导致基因组的大小变得更小（36）。鉴于 CRISPR 计数和在该生物体基因组中观察到的大量噬菌体编码元件，这些可能是O. formigenes基因组较小的一些驱动力。表 4）。
| 基因组特征 | 产酸草酸杆菌HC-1 | 产酸草酸杆菌 HOxBLS | 大肠杆菌Nissle 1917 |
|---|---|---|---|
| 产酸草酸杆菌组名称b | I | II | 不适用 |
| 基因组大小 (Mb) | 2.46887 | 2.48830 | 5.44120 |
| 总基因计数 | 2,275 | 2,292 | 5,303 |
| 蛋白质编码基因 | 2,205 | 2,126 | 4,694 |
| GC％ | 49.6 | 52.7 | 50.6 |
| CRISPR计数 | 4 | 6 | 0 |
| 噬菌体蛋白产生序列 (ORF) c | 154 (154) | 184 (212) | 59 (161) |
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a来自联合基因组研究所 (JGI)/综合微生物基因组和微生物组 (IMG/M) ( 107 )、国家生物技术信息中心 (NCBI) 网站和 PHASTER ( 116 ) 网站的数据和资源用于编制本数据集。纳入Escherichia coli Nissle 1917 用于比较目的 ( 34 )。
b组名称来自 Jensen 和 Allison ( 15 )。
c ORF，开放阅读框。该值表示在噬菌体和细菌蛋白质数据库中匹配的蛋白质数量，这些区域被 PHASTER 完整程度评分标准评分为“完整”。欧。甲醛HC-1, O . formigenes HOxBLS 和E.coli Nissle 1917 分别包含 3 个（共 3 个）、3 个（共 4 个）和 1 个（共 5 个）完整的原噬菌体区域。括号中的值包括在噬菌体和细菌蛋白质数据库中的所有前噬菌体区域中的匹配，这些区域被评分为完整、不完整和有问题。
O. formigenes基因组的其他特征在图 7. 基因谱（例如，Pfam、COG、KEGG Orthology、TIGRfam、酶、KEGG 途径、MetaCyc 途径、跨膜蛋白、信号肽蛋白和 IMG 途径）在O. formigenes菌株 HC-1 和 HOxBLS 之间非常相似。一些值得注意的例外是 HOxBLS（II 组菌株）属于具有功能预测的蛋白质编码基因类别，其中基因数量 (%) 减少，或属于生物合成簇中的蛋白质编码基因类别，其中基因完全缺席的。后者继续建立在第二组菌株相对于体外生长的稳健性下降的潜在原因之上。有趣的是，在融合蛋白编码基因的类别中，O. formigenesHC-1 和 HOxBLS 基因数 (%) 实际上高于E. coli Nissle 1917 (3.9%) (分别为 7.7 和 10.2%) (图 7）。基因融合（也称为“复合基因”）是在生物体（包括原核生物）中产生新基因的机制之一，其中平均含有 14.5% 的复合基因（37、38）。基因融合以及 CRISPR 系统和噬菌体编码元件如何共同帮助塑造基因组，从而塑造O的进化史。formigenes，有待阐明。
图 7
产酸草酸杆菌菌株的基因组特征和组成。来自联合基因组研究所 (JGI)/综合微生物基因组 (IMG) ( 107 ) 和国家生物技术信息中心 (NCBI) 网站的数据和资源被用于准备该数据集。纳入大肠杆菌Nissle 1917 ( 34 ) 是为了进行比较。
直系同源基因簇 (COG) 是一种多功能工具，多年来一直用于对来自细菌和古生菌的测序基因组进行注释和比较分析( 39 , 40 )。COG 由直系同源蛋白质编码基因家族组成，可以分配到 26 个功能类别中的一个或多个。这允许对生物体的新陈代谢、细胞加工和信号传导、信息存储和加工以及特征不佳的蛋白质进行详细比较。在O. formigenes之间可以看到基因分布的微小差异（0.5 至 1.0%）以下 COG 功能类别中的 HC-1 和 HOxBLS：J、翻译、核糖体结构和生物发生；P，无机离子转运和代谢；l、复制、重组、修复；C、能源生产与转化；X，移动组：前噬菌体，转座子（图 8）。菌株之间差异的一个例子是，118 个 COG 在 I 组菌株 HC-1 和 OxCC13 之间共享，而这些相同的 118 个 COG 在 II 组菌株 HOxBLS 中不存在。同样，HOxBLS 有 70 个 COG。在O. formigenes菌株和大肠杆菌Nissle 1917之间分配到 COG 类别的基因中可以看到更大的差异（1% 到 3%），其中最大的差异在“碳水化合物转运和代谢”类别（G 类）中。在E. coli Nissle 1917 中，约 11% 的带有 COG 的蛋白质编码基因与此功能类别相关，而在O. formigenes菌株中这一比例为 4%。图 8）。鉴于O. formigenes作为草酸盐代谢专家的性质，这似乎是合理的，它无法利用其他底物（包括碳水化合物）作为能量来源。
图 8
Oxalobacter formigenes HCI-1、Oxalobacter formigenes HOxBLS 和Escherichia coli Nissle 1917的直系同源基因簇 (COG) 类别中基因的分布和丰度。出于比较目的，包括了Escherichia coli Nissle 1917 ( 34 )。来自联合基因组研究所 (JGI)/综合微生物基因组 (IMG) 网站 ( 107 ) 的数据和资源用于准备该数据集。对于O. formigenes HC-1、O. formigenes HOxBLS 和E. coli Nissle 1917，分别有 746、737 和 1291 个基因不在 COG 中。
基于质谱的鸟枪法蛋白质组学鉴定了 I O. formigenes菌株 OxCC13 ( 33 ) 中 1,867 个独特蛋白质编码基因中的 1,822 种蛋白质。从所提供的蛋白质数据集中，很明显这种生物体包含一系列代谢途径，这些途径通过营养变化和环境压力介导适应。例如，蛋白质组学分析显示超氧化物歧化酶在静止期相对于对数期增加，表明O. formigenes具有在大肠厌氧环境之外持续存在的能力。
最近的研究集中在O. formigenes是否在其代谢组中表达在其他草酸盐降解细菌中是独特的和/或无法检测到的特征 ( 41 , 42 )。这些有趣的研究揭示了与嗜酸乳杆菌、格氏乳杆菌和动物双歧杆菌的裂解物制备相比， O. formigenes HC-1 菌株的裂解物制备物中的一组 12 个独特特征( 41 )。关于O. formigenes代谢组和脂质组的差异在 HC-1 和 OxWR 菌株中，个体代谢产物的相对表达存在显着和显着差异，尽管发现两个菌株之间的代谢组和脂质组在很大程度上是保守的 ( 42 )。未来的研究需要“扩展草酸杆菌属的已定义代谢组和脂质组”。( 42 )。例如，此类研究可能会导致识别可以增强肠道草酸盐分泌和定植恢复能力的特定分子。
几项研究已经调查了人类中O. formigenes定植的流行率和丰度。然而，缺乏用于检测O. formigenes的标准化方法（基于培养与分子）以及生物体的低丰度使得对定植的准确评估具有挑战性。O. formigenes定植频率因不同人群而异。在印度北部进行的一项研究表明，65% 的健康成年人存在O. formigenes定植 ( 43 )。在韩国首尔对健康成年人进行的一项研究表明，79% 的人（233 人中有 197 人）存在oxc基因（O. formigenes的标记）（44）。在健康的日本参与者中，54 名男性中的 80% 和 34 名女性中的 62% 显示出O. formigenes定植( 45 )。在对美国健康成年人进行的两项大型队列研究中，约 30% 的人被O. formigenes定殖（46、47）。这大大低于其他国家。佩贝尼托等人。研究了 3 个不同人群的 O. formigenes定殖，发现与坦桑尼亚的 Hadza 人或委内瑞拉的美洲印第安人相比，美国队列中的O. formigenes定殖要低得多 ( 48 )。克莱门特等人。研究了O. formigenes在与西方医学或文化没有接触的 Yanomami 村的成员中定植，并且与美国相比，也发现了高得多的O. formigenes定植流行率 ( 49 )。克莱门特等人。进一步分层抗生素使用，发现西方化显着影响O. formigenes定植与抗生素暴露无关。这些数据表明，我们的现代生活方式导致有益微生物群的消失 ( 50 )。事实上，在粪便样本中，O. formigenes检测到，肠道微生物群更加多样化，全球微生物网络显示出更多的连接性和对模拟干扰的弹性。这表明O. formigenes的流行和丰度是肠道微生物组生态状态的一个指标 ( 51 )。
对来自人类微生物组计划 (HMP) 和美国肠道计划 (AGP) 的测序数据（全鸟枪法测序和 16S rRNA）的分析表明，不止一种O. formigenes菌株可能在人类肠道中定殖，其中 I 组菌株更为普遍比第二组 ( 46 , 51 )。这两项分析还表明，O. formigenes的相对丰度变化 3 个对数，平均值为 2.9 × 10 4，这突出表明，当使用包括 PCR 在内的分子方法时，粪便中的O. formigenes数量有时可能达到或低于检测限.
“直到他们开始在环境中四处爬行”（52）时，儿童才会被O. formigenes定殖。啮齿动物的对照研究也证实了O. formigenes水平传播 ( 53 , – 55 )。Cornelius 和 Peck 在大鼠中进行了一项非常精巧的研究，表明所有后代在断奶后 7 天才发生定殖，重要的是，定殖来自养母，而不是生母，在断奶的仔猪从定殖的生母转变为寄养母亲各自携带不同的O. formigenes菌株（53）。在我们的实验室中，我们还在成年常规小鼠和无菌小鼠中解决了这个问题。当相同数量的常规O. formigenes菌株OxCC13 定殖小鼠和非定殖小鼠共同饲养时，非定殖小鼠会被 O.formigenes 定殖，从而确认水平传播。将单个O. formigenes菌株 OxCC13 单定殖的无菌小鼠引入由四只非定殖的无菌小鼠组成的笼子中，也会导致所有无菌小鼠都被O. formigenes定殖（55）。
我们对O. formigenes知识的主要差距之一是缺乏有关影响O. formigenes定植的因素的信息。在人类 ( 56 )、小鼠 ( 57 ) 和大鼠 ( 58 ) 中进行的受控饮食研究表明，饮食中的草酸盐和钙对O. formigenes数量具有深远影响。还有证据表明大鼠的腔内脂肪含量 ( 59 ) 会抑制O. formigenes减少尿中草酸盐排泄的能力；然而，尚不清楚这是否是人类的一个促成因素。姜和同事确定了O. formigenes健康人类受试者粪便中的细菌数量，发现粪便细菌数量增加了 12 倍，因为饮食中的草酸盐增加了 15 倍。图 9) ( 56 )。值得注意的是，膳食钙摄入量增加 5 倍，由于钙对草酸盐的高亲和力，这将限制草酸盐的生物利用度，使粪便中的产气霉数量减少约 5 倍。对草酸盐的依赖性以及膳食钙和甲醛氧量之间的反比关系可能导致肾结石形成者的定植丧失，因为鼓励这些患者保持足够的钙和低草酸盐摄入量。这种潜在的动态值得进一步调查。
图 9
相对于膳食草酸盐（红色三角形）或膳食钙（黑色方块）的变化，人类受试者粪便中的O. formigenes的量。不同草酸盐饮食阶段的每日钙摄入量为 1,000 毫克，而不同钙饮食阶段的每日草酸盐摄入量为 250 毫克。实时定量 PCR (qPCR) 用于定量O. formigenes数量，并使用 5.5 × 10 4 CFU/ng DNA 将 qPCR 数据转换为每 g 粪便中的O. formigenes数量 ( 108 )。误差线代表 SEM。（经 Wolters Kluwer Health 许可，改编自参考文献56。 ）
两项针对人类的大型队列研究调查了O. formigenes与宿主的关系。Kelly 及其同事对 94 名O. formigenes定植受试者和 146 名非定植健康个体的分析未显示性别、种族、教育、美国居住地区、体重指数、尿路感染史、肾结石家族史的任何影响, 和利尿剂对O. formigenes定植频率的使用 ( 47 )。在对 AGP 数据库中 4,900 多个样本的多元分析中，O. formigenes的相对丰度与年龄增加、女性、高加索种族、非美国居住地、正常 BMI、更高的教育程度以及一年内未接触抗生素有关 ( 51 )。有趣的是，在完成食物频率问卷的 197 名受试者中，O. formigenes相对丰度与膳食草酸盐摄入量无显着相关性，但与膳食钙摄入量和膳食草酸盐与膳食钙摄入量的摩尔比呈负相关（51）。在这方面，包括印度、中国、韩国和日本在内的一些东方国家的膳食钙摄入量远低于美国。( 60）。鉴于这些研究的各种结果，需要进一步调查文化、人口统计、潜在的医疗条件、西药的可及性和饮食如何影响不同人群中的福尔米金斯菌的频率。
年轻时口服抗生素和抗生素暴露与人类结石形成风险增加有关 ( 61 , – 63 ) 和O. formigenes定植率降低 ( 47 )。人类的O. formigenes菌株对常见的抗生素敏感 ( 64 )。西杜等人。表明在囊性纤维化患者中O. formigenes定植的频率较低是由于广泛使用抗生素（65）。西杜等人。还报道了与抗生素治疗和草酸钙结石形成中缺乏O. formigenes定植的明显关联（ 66）。西纳等人。评估了用抗生素治疗复发性尿路感染 (UTI) 的女性草酸钙结石形成者中的O. formigenes定植和尿草酸盐排泄的关系，发现与没有复发性尿路感染的女性相比，该队列中的尿草酸盐排泄显着更高 ( 67 )。Kharlamb 等人也观察到了同样的关联。当观察接受三联抗生素治疗幽门螺杆菌感染的个体时 ( 68 )。有人提出，在使用抗生素后，草酸盐降解细菌（如O. formigenes ）的损失会因尿中草酸盐排泄增加而导致肾结石风险增加（65）。
O. formigenes定殖是否受到其他微生物的影响尚不清楚，并且仅在一项利用O. formigenes定殖小鼠模型的研究中得到解决（55）。这项研究表明，将确定的 7 种非草酸盐降解细菌（改变的 Schaedler 菌群）混合物引入单定殖O. formigenes菌株 OxCC13 的小鼠中，对O. formigenes肠道数量或O. formigenes的能力没有影响。降解肠道草酸盐。未来对 gnotobiotic 小鼠的研究应解决其他草酸盐降解剂对肠道O. formigenes的影响数字和草酸盐稳态。未来的研究还可以考虑使用肠道恒化器模型 ( 69 )，因为这些体外方法可以直接评估无宿主环境中微生物群落的动态。事实上，它是一种产甲烷、草酸盐降解的富集培养物，在羊瘤胃内容物的恒化器中建立，产生了第一个厌氧草酸盐降解细菌O. formigenes菌株 OxB ( 10 , 19 , 70 )。
在我们自己的研究过程中，我们观察到除了定植的持续时间之外，还有其他未知因素会影响小鼠中的蚁生菌定植。例如，我们之前报道过 AGT（一种羊毛氨酸乙醛酸氨基转移酶）敲除小鼠可以被O. formigenes菌株OxWR定殖，但在大约 2 周后开始迅速失去定殖，到 7 周时，所有 AGT 敲除小鼠都有失去殖民化（71）。最近，我们还报道了在腺瘤（DRA；Slc26a3）敲除小鼠中下调的小鼠很容易被O. formigenes定殖菌株 OxWR，但以与 AGT 敲除模型类似的方式失去定殖 ( 72 )。有趣的是，DRA/AGT 的双重敲除对O. formigenes菌株 OxWR 定殖具有抗性 ( 72 )。还值得注意的是，所有 C57BL/6 对照组均经口灌胃O. formigenes菌株 OxWR、 OxCC13或 HC-1 在常规食物中维持数月的定殖 ( 54、57 ) 。在 C57BL/6 对照小鼠中进行的一项研究还表明，O. formigenes菌株 OxCC13 的定植对短期饮食草酸盐剥夺具有抗性（57）。据推测，一些小鼠品系和可能一些人类的腔内环境不接受，或者只是暂时接受，O. formigenes定植。检查宿主物种之间肠道草酸分泌、肠道化学成分和肠道微生物组的差异可能会进一步阐明影响O. formigenes定植的因素。
自 1980 年发现以来，O. formigenes作为治疗草酸钙肾结石患者的潜力一直在考虑之中。尿草酸排泄增加是此类结石形成的公认风险因素 ( 73 )。高膳食草酸盐吸收导致增加草酸盐输送到肾脏，从而增加草酸钙肾结石形成的风险。由于哺乳动物身体天生不具备能够代谢草酸盐的酶，因此可降解草酸盐的肠道微生物群可能会影响尿中草酸盐的排泄。对少量人类受试者的早期病例对照研究表明，O. formigenes定植可能对结石病具有保护作用，因为与未定殖的个体相比，定殖的O. formigenes中尿草酸盐排泄的测量值较低 ( 62 , 74 , 75 )。然而，在尿液收集过程中，草酸盐排泄量存在很大差异，并且缺乏对饮食草酸盐和钙的控制。另一项研究表明，与食用标准化饮食的O. formigenes阴性患者相比，O . formigenes定植肾结石患者的 24 小时尿草酸排泄和血浆草酸盐显着降低( 76 )。还发现定植与结石发作次数呈显着负相关（76）。1995 年，韩等人。是第一个显示O. formigenes定殖和结石形成之间的反比关系( 77 )。考夫曼等人。后来在更大的患者队列中表明，O. formigenes定植与复发性肾结石形成的风险降低 70% 相关（78）。这种反比关系已在随后的许多研究中得到证实（62、75、76、79、80）。尽管大量的研究表明O. formigenes定植与结石病之间存在反比关系，但 O. formigenes的定植仅在 55% 的研究中显示 24 小时尿草酸盐排泄量较低，这表明其他因素可能是促成因素 ( 81 )。姜及其同事的对照饮食研究可能部分解释了这些结果，他们表明，只有在摄入草酸含量适中的饮食时，与未定植的个体相比，自然定植于甲醛的健康个体（人类）在24小时尿中排出的草酸盐更少钙含量低（图 10) ( 56 )。
图 10
（A 和 B）健康受试者在草酸盐（A）和钙（B）不同的营养控制饮食中未定植（黑色方块）和定殖O.formigenes （红色三角形）的 24 小时尿草酸盐排泄。在不同草酸盐的饮食中，每日钙摄入量为 1,000 毫克，在不同钙的饮食中，每日草酸盐摄入量为 250 毫克。在 250 mg 草酸盐/400 mg 钙饮食中，被O. formigenes定殖的个体比未定殖的个体排出的尿草酸盐明显更少；用*表示，P = 0.026。误差线代表 SD。（经 Wolters Kluwer Health 许可，改编自参考文献56。 ）
虽然还有其他肠道微生物可以降解草酸盐（“通才”），包括一些双歧杆菌和乳酸杆菌菌株（82），但对小鼠的研究表明，相比之下，在减少尿草酸盐排泄方面， O. formigenes更为优越。例如，虽然O. formigenes HC-1 菌株定植导致常规 (C57BL/6) 小鼠 ( 71 )的尿草酸排泄减少 90% ，但动物双歧杆菌定植导致减少 44% ( 83 )。类似地，在小鼠定植后，尿草酸浓度分别降低了 34% 和 32%。分别为嗜酸乳杆菌和格氏乳杆菌( 54 )。O. formigenes定植对尿草酸排泄的这种优越效果可能是由于诱导肠草酸排泄和高效管腔草酸降解的双重作用。
过去十年的先进“组学”研究允许对健康个体和肾结石形成者的肠道微生物组进行更深入的检查 ( 81 , 84 , – 91 )，并证明 (i) O. formigenes在导致胃肠道饮食草酸盐降解的多物种细菌网络的中心，以及（ii）来自结石形成者的粪便样本中参与草酸盐降解的基因的细菌代表性显着降低，这可能导致该队列中尿草酸盐增加。在人类微生物群的多组学数据（来自 >1,000 名受试者的 >3,000 个样本）分析中，Nazzal 等人。( 84) 表明，在能够降解草酸盐的多种细菌中，O. formigenes在健康成人中在转录上占主导地位。此外，他们证明炎症性肠病 (IBD) 患者的肠道草酸盐水平升高，草酸盐降解基因的转录水平较低。有趣的是，他们的数据表明，没有O. formigenes定殖或低于检测水平的定殖是草酸盐降解功能降低的原因。
对健康的非肾结石形成个体的人类粪便中的O. formigenes进行计数表明， O. formigenes仅占整个肠道微生物群的一小部分 ( 56 )。许多这样的低丰度细菌被认为通过占据特定的营养壁龛而在肠道中存活，在这些壁龛中，它们的食物来源的竞争是有限的（92）。事实上，体外培养研究 ( 93 ) 和人体研究 ( 56 ) 都表明，O. formigenes比其他肠道细菌更有效地利用草酸盐。蒋及其同事（56) 还表明，在草酸盐摄入量低的情况下，非定植个体的微生物组的草酸盐降解能力可以忽略不计，但随着适应摄入较高水平的膳食草酸盐而增加；每日膳食草酸盐摄入量为 250 毫克和 750 毫克，粪便中草酸盐回收率分别为 ∼80% 和 ∼60%（图 11）。
图 11
在不同草酸盐的营养控制饮食中，定殖（黑条）和未定殖健康受试者（红条）的O. formigenes粪便草酸盐。每日钙摄入量为 1,000 毫克。误差线代表 SEM。（经 Wolters Kluwer Health 许可，改编自参考文献56。 ）
在啮齿动物中的大量报道已经证明了肠道O. formigenes在减少尿中草酸盐排泄方面的有益作用。最初，这被认为仅是由于O. formigenes降解草酸盐的饮食来源，从而限制了其吸收。然而，后来的研究表明，肠道O. formigenes具有独特的双重作用，即通过促进体循环中肠道草酸的消除，与宿主肠道上皮细胞相互作用，这与肾脏排泄的显着减少有关 ( 58 , 59 , 71 , 72 , 94 )。在大鼠和小鼠中的这些观察导致了以下提议：O. formigenes（菌株 OXWR 和 HC-1）可能会产生促分泌素，一种可能是天然蛋白质的物质（95），它介导草酸盐跨上皮转运通过定植肠组织的改变（58）。此外，即使膳食草酸盐的供应可以忽略不计，这种将O. formigenes的必需底物（草酸盐）从血液转运到肠道的机制也可能解释了O. formigenes的存活（ 57）。
最近的一项体外研究表明，来自O. formigenes菌株 OxB 培养物的无细胞上清液可刺激人肠道 Caco-2-BBE 细胞中的草酸盐分泌 ( 95 )；然而，这些发现并没有被不同的小组复制（14），需要进一步调查。阿文斯等人。( 95 ) 还表明直肠给药来自O. formigenes的无细胞上清液菌株 OxB 培养物导致 PH1 小鼠模型中尿草酸盐排泄减少；然而，仍需要利用静脉内施用的草酸盐同位素直接测量肠道草酸盐分泌，然后在肠道中进行测量，以量化该途径的程度。令人感兴趣的是 OxThera Pharmaceuticals 在 2015 年提交的一项专利，该专利涵盖了分离和施用源自O. formigenes的促分泌剂的发明，该促分泌剂可以增强草酸盐分泌到肠腔中 ( 96 )。尽管该专利中描述的工作没有确定任何令人信服的促促分泌剂候选物，但确定了由O. formigenes分泌的一种或多种生物活性因子诱导草酸盐分泌可能是减少 PH1 患者草酸盐负担的有效疗法。
之前有一项研究解决了定殖缺乏蚁螟的个体的能力，在该研究中，两个未定殖蚁螟的健康成年人在摄入含有~ 10 8培养的活蚁螟菌株 HC的高草酸盐膳食后被定殖-1 细胞 ( 97 )，随后保持定殖 9 个月。尽管这项研究让受试者在成功定植前食用高草酸盐膳食，但在小鼠中进行的一项研究表明，定植可能不需要用补充草酸盐的饮食“启动”（54）。因此，未来的人类研究应该探索在口服摄入甲醛后，是否需要富含草酸盐的饮食才能成功定植。其他研究了摄入O. formigenes后的定植研究并没有成功。OxThera 公司进行的一项临床试验，其中O. formigenes菌株 HC-1 以肠溶胶囊内的冻干形式或作为冷冻糊剂提供给 PH1 患者，结果只有少数患者在治疗后仍保持定植。98、99 ) 。_ 最近的临床研究也没有显示与对照组相比尿中草酸盐排泄量显着减少（99，100 )。这些研究中人类定植频率低的原因目前尚不清楚，但可能包括：（i）与提供的接种物（HC-1株）的配方或如何将接种物给予患者相关的问题；(ii) PH1 患者对不确定宿主因素定植的抵抗力；或 (iii) 这些患者中未知的肠道微生物组相关因素。然而，应该指出的是，一项涉及非定植健康成年人的人体研究 ( 97 ) 表明，在摄入大量生物质O. formigenes HC-1 (10 8活细胞），口服草酸钠负荷（2 mmol/70 kg 体重）；摄入O. formigenes前的尿草酸排泄量为 3.0 ± 0.6 mg/h ( n = 4)，而摄入O. formigenes 为 1.9 ± 0.1 mg/h 。因此，更有弹性的O. formigenes对非定植结石形成者的定植可能是帮助降低草酸钙结石形成者中结石风险的有效方法。
在阿拉巴马大学伯明翰分校进行的一项由健康人类志愿者参与的正在进行的临床试验 ( NCT03752684 ;clinicaltrials.gov) 正在测试未定殖O. formigenes的个体是否可以用O. formigenes菌株 OxCC13的活培养物定殖。还在评估O. formigenes定植前后固定草酸盐饮食中尿草酸盐排泄的变化。该试验表明，健康个体在摄入单剂量的约10 10 个活培养的O. formigenes细胞后可以很容易地定殖，在摄入O.formigenes 6 个月后，15 名参与者中只有一个失去了定殖。
关于O. formigenes如何建立和维持肠道定植仍有许多需要了解。解开这些机制对于非定植结石形成者的定植可能特别重要。有必要进一步研究与宿主来源的草酸盐的定植弹性和肠道分泌有关的因素。此外，鉴于用O. formigenes进行的临床试验失败，显然需要进行更全面的检查，以 (i) 将这种严格的厌氧菌作为纯培养物或作为合成的草酸盐降解微生物的成员进行最佳递送的最佳实践联合体，或作为来自O. formigenes的粪便微生物移植的一部分- 殖民捐赠者；(ii) 肠道中草酸盐降解菌和非草酸盐降解菌之间的相互作用；(iii) 这些细菌如何共同影响尿中草酸排泄和结石风险
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