本文是今年六月发表在cancer immunology research，影响因子为9.188，关键词是膀胱癌，肿瘤浸润淋巴细胞，肿瘤突变负荷，PD1和PDL1。
肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）约占侵袭性尿路上皮癌（UBC）的三分之二并具有高发病率和死亡率。三分之二的侵袭性尿路上皮癌UBC患者会在5年内复发或疾病进展。本文应用了135例全膀胱切除术的MIBC标本对肿瘤浸润淋巴细胞（sTIL）进行研究，同时还使用了407例TCGA数据库病例用以验证。
结果证明了肿瘤免疫微环境中肿瘤浸润淋巴细胞的空间分布及数量可以预测肿瘤炎症亚型、患者存活和免疫检查点的表达。高肿瘤浸润淋巴细胞提示一种80% 5年DFS（无病生存期）的炎症表型，而非炎症表型DFS则小于25％。肿瘤浸润淋巴细胞浸润程度取决于膀胱癌亚型。高炎症表型还与新抗原负荷增加、高TMB和特异性突变模式相关。作者还研究了肿瘤免疫微环境对预后的影响：在TCGA队列中研究了肿瘤浸润淋巴细胞对预后影响；肿瘤免疫微环境与浸润淋巴细胞对预后的影响相关。除此之外研究还表明，高肿瘤浸润淋巴细胞的患者辅助化疗效果好，这表明肿瘤浸润淋巴细胞和肿瘤亚型检测可以用于预测MIBC患者疗效和生存。
1.尿路上皮膀胱癌（UBC）是世界上第10位最常见的恶性肿瘤之一，也是泌尿生殖道第2位最常见的癌症。目前用于肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）的治疗包括根治性膀胱切除术，双侧淋巴结切除术联合铂类围手术期化疗，。MIBC的特点是5年生存率差，只有40-60％。 MIBC的分子特征表现出两种主要表型：管腔型和基底肿瘤型，具有显着的预后和预测价值。免疫治疗为转移性UBC患者提供了新的治疗选择。 FDA已经批准了使用针对PD-1或PD-L1的免疫治疗药物治疗MIBC，这些药物已证实在转移性UBC中具有延长的稳定反应。
2.肿瘤免疫微环境中的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）已经研究了许多年，其中一篇论文初步描述了UBC中的浸润性T细胞的特征。TIL可由T，B和自然杀伤（NK）细胞组成。 CD8 +细胞毒性T效应细胞在抑制肿瘤发展中起关键作用，而CD4+T辅助细胞可具有促肿瘤或抗肿瘤作用。TIL的组成可以预测不同肿瘤类型患者的预后，包括结肠直肠癌，乳腺癌和卵巢癌
3.免疫基因表达模式在尿路上皮膀胱癌UBC中存在富集，并且免疫检查点相关基因的表达在肿瘤中增强，例如，T细胞炎症相关基因。目前只有小型的患者队列的有限数据表明TIL对可以提高患者的存活率。由于TIL的存在似乎可以预测对免疫肿瘤治疗的反应，因此需要对肌肉浸润性膀胱癌MIBC的肿瘤免疫微环境进行表征。
CCC-EMN队列中具有高肿瘤浸润淋巴细胞浸润的肿瘤的特征在于CD3 +，CD8 +，CD68 +，CD56 +，PD-1 +，PD-L1 + IC和大量TLS的密集浸润。为了测试肿瘤浸润淋巴细胞表型是否提供了有关浸润前部和肿瘤中心TIME的空间组织的信息，作者根据肿瘤中心和肿瘤侵袭前沿的肿瘤细胞以及免疫细胞的种类进行了层次聚类分析。
热图要素分析：
加权配对算术平均法：是一类基于对象平均相异性或聚类簇中心的聚类方法，fold change表示该细胞表达量相对于所有细胞表达量加权平均值的相对含量。红色代表该肿瘤/免疫细胞含量较高，且颜色越深含量越高，绿色代表含量较低，且颜色越深含量越低。
2.immune phenotypes：根据细胞的聚类分析得到的四个免疫表型，分别是无炎症型，低炎症型，高炎症型和逃逸型。
3.MIBC原本固有的分型：双阴性型，管腔型，EMT/p53样管腔型，基质型
4.sTILs%：每种表型含有的肿瘤浸润淋巴细胞百分比。
作者最后得到了四种肿瘤的免疫表型：
（i）簇A（无炎症型；占病例的36％）– 肿瘤浸润淋巴细胞极低s，PD-1 +和PD-L1 + IC的浸润非常低，而PD-L1 + TCs缺失；
（ii）B组（炎症反应较弱；占病例的29％）– 肿瘤浸润淋巴细胞低，低PD-1 +和PD-L1 + IC浸润和PD-L1 + TCs缺失；
（iii）C组（炎症反应较强；22％）–高肿瘤浸润淋巴细胞，高PD-1 +和高PD-L1 + IC浸润，中等数量的PD-L1 + TC；
（iv）D组（逃逸组；13％）–中度肿瘤浸润淋巴细胞，中等数量的PD-1 +，低PD-L1 + IC和高PD-L1 + TC。
图1. CCC-EMN队列的肿瘤免疫细胞表型的层次聚类。
（A）根据免疫细胞表型和空间肿瘤位置（IF =侵袭前沿，center=肿瘤中心，TC =肿瘤细胞，IC =免疫细胞）分类基质肿瘤浸润淋巴细胞（肿瘤浸润淋巴细胞）和巨噬细胞。作者使用代表每平方毫米的绝对细胞计数（log2转换）的无监督分层聚类分析揭示了四种肿瘤免疫表型（在热图的左侧和下方指示）。揭示了四个集群：集群A（无炎症），集群B（轻度炎症），集群C（重度炎症）和集群D（逃逸组）。
高炎症型的肿瘤患者（C组）的疾病特异性5年生存率为80.0％，而无炎症型的肿瘤患者（簇A）在5年内存活率低于24.1%（图1D）。具有较高PD-L1 TC表达的逃逸型的肿瘤患者（簇D）5年疾病特异性存活率（DSS）为29.3％。
（D）基于免疫细胞表型的疾病特异性存活率（DSS）的Kaplan-Meier回归。 生存图的左下角显示了单变量对数秩p值。 在生存曲线上方显示了通过多变量Cox回归得出的整个指标“免疫表型”的p值，其后是发高和未发高危的多元风险比（HR）。
除此之外，作者还进行了相关性分析，发现肿瘤浸润淋巴细胞的数量与肿瘤边缘和肿瘤中心的不同免疫细胞群是具有相关性的，主要是正相关的关系。
（E）肿瘤浸润淋巴细胞分数的非参数Spearman秩相关性（Spearmanρ）与CD3 +、CD8 + T细胞，CD68+巨噬细胞，PD-1 +免疫细胞，CD56 + NK细胞以及PD-L1的IC和TC的占比具有相关性。
接下来，作者分析了T细胞基因（CD3Z（CD247），CD8A），干扰素-γ（CXCL9）诱导的T细胞趋化因子以及两个与之相关的免疫检查点[PD-1（PDCD1）和PD-L1（CD274）]的基因表达与肿瘤浸润淋巴细胞的浸润之间的相关性，由图A-B发现两者呈高度相关（图2A-B）。将这5个基因聚在一起，揭示出三个分层的簇，与肿瘤浸润淋巴细胞的数量相对应。在各类亚型和免疫表型中，基质型和高炎症型主要聚集在免疫基因高表达组，与较高的肿瘤浸润淋巴细胞百分比显著相关。
图2. CCC-EMN队列中的肿瘤浸润淋巴细胞和免疫基因表达（n = 135）。
（A）基于图1A中讨论的亚型和表型，使用无监督的层次聚类分析进行免疫细胞基因表达。
（B）免疫基因簇的肿瘤浸润淋巴细胞的浸润比例。
高炎症型肿瘤的临近肿瘤的三级淋巴结结构（TLS）数量最多（中位数：11个TLS），而无炎症和逃避组表型的肿瘤三级淋巴结结构TLS数量最少（未发炎中位数：0个TLS;逃避中位数：3个TLS（图1C）。炎症表型与三级淋巴结结构TLS到肿瘤浸润前沿的距离相关，无炎症型和逃逸组的TLS到肿瘤浸润前沿的最短距离均显著大于高炎症型肿瘤（中位：37μm，中位：423μm）（图1C）。
(C)包括淋巴细胞的三级淋巴结构TLS的数量和距离，以及它们与肿瘤表型的关系。
图C表示的是基于肿瘤浸润细胞的三分位数分裂的疾病特异性生存分析。三分位数分裂是使用JMP SAS 13.2（美国北卡罗来纳州卡里的SAS研究所;三分位数拆分; T1 <p = 1/3; p = 1/3 <T2 <p2/3，T3>2/3）将相应的队列分为三个部分，简单来说，就是根据肿瘤浸润细胞所占百分比将其分类为T1,T2,T3三类，T3的肿瘤浸润淋巴细胞最多，T1的最少。图D是研究三分位分类与免疫基因表达量的关系。
从图C和D可以看出，肿瘤浸润淋巴细胞高度浸润（T3）和T细胞相关基因表达高(T3)的患者的肿瘤特异性生存率（DSS）明显更好（图2C-D）。 此外，在多变量Cox回归模型中，高肿瘤浸润淋巴细胞浸润也是较好的DSS的独立预测因子。
（C）基于肿瘤浸润淋巴细胞三分位数分裂（1-3分位数：T1-T3）的DSS的Kaplan-Meier回归。 对数秩p <0.0001; 指标“ 肿瘤浸润淋巴细胞三分位数”的多变量p <0.0001。 对数对数秩p值显示在生存图的左下角。 生存曲线上方描绘了通过多变量Cox回归得出的整个指标“ 肿瘤浸润淋巴细胞三分位数”的p值，随后是三分位数第3组与三分位数第1组的多元HR。生存曲线下方的表格显示了处于不同风险中的患者三分位数拆分组（每个拆分组的第一列患者总数），其后各列显示以20个月为增量的风险患者数。
（D）基于三分位基团的免疫基因表达（PDCD1，CD274，CXCL9，CD3A，CD3Z）
作者根据免疫相关基因的表达量检测到三个不同的分级炎症免疫细胞簇（ICC）：高炎症（ICC高），低炎症（ICC低）和无炎症（图3A）。 具有炎症表型的肿瘤表现出高的肿瘤浸润淋巴细胞浸润，并与基底鳞状表型和一部分管腔肿瘤相关。 此外65.9％的管腔乳头状肿瘤被确定为无炎症型，表现为肿瘤浸润淋巴细胞较低或没有肿瘤浸润淋巴细胞（图3A）。
同时，肿瘤浸润淋巴细胞与TCGA队列的肿瘤亚型之间的相关性也证实，与管腔浸润的肿瘤（第二高计数）以及管腔和管腔乳头状肿瘤相比，基底鳞状肿瘤表现出最高的肿瘤浸润淋巴细胞（TCGA亚型；图3A）。另外，高炎症簇的肿瘤抗原提呈标记表达也较高，肿瘤浸润淋巴细胞的百分比也较高。
图3. TCGA的肿瘤免疫微环境（n = 407）。
（A）与免疫细胞炎症相关的59个基因的无监督分层聚类揭示了三个免疫细胞簇（ICC）：高炎症型，低炎症型和无炎症型。 肿瘤亚型的分布及其与抗原呈递细胞标志（AGPS），肿瘤浸润淋巴细胞的百分比的相关性在ICC簇下方，扇形图（右）和柱状图（％）中显示（右）。
为了研究肿瘤浸润淋巴细胞的预后影响，作者依旧应用了三分位数分割法。 图B显示肿瘤浸润淋巴细胞百分比较高的患者五年生存率较好。 在图C中，与高肿瘤浸润淋巴细胞浸润对预后的影响一致，特定免疫细胞基因CD8A，CD3Z，CXCL9和FOXP3以及免疫细胞检查点调节基因PDCD1（PD-1），CD274（PD-L1），LAG3，CTLA4和IDO1的基因表达在肿瘤浸润淋巴细胞百分比较高的人群中明显更高（图3C）。
（B）基于肿瘤浸润淋巴细胞三分位数分裂（T1-T3）的生存的Kaplan-Meier回归。 表格显示三分位数拆分组（第一列患者总数），其后各列显示以20个月为增量的风险患者数。
（C）基于三分位数分裂的细胞毒性TEFF和辅助T细胞（CXCL9，CD3A，CD3Z）和免疫检查点（CTLA4，IDO1，PDCD-1 [PD-1]，CD274 [PD-L1]，LAG3）基因表达。
作者预测明显更高的肿瘤浸润淋巴细胞的存在将与增加的抗肿瘤免疫反应相关。 因此计算了TCGA队列中不同的免疫细胞群的百分比。图D的相关性分析揭示了肿瘤浸润淋巴细胞与所有IC群体相对数量的相关性（ρ= 0.63）：CD8 + T细胞（ρ= 0.49），NK细胞（ρ= 0.52），CD4 + T细胞（ρ= 0.58）， 以及M1巨噬细胞（ρ= 0.63）和M2巨噬细胞（ρ= 0.43），都是正相关的关系。
（D）通过CIBERSORT算法计算的肿瘤浸润淋巴细胞和不同免疫细胞群的Spearman等级相关性。
然后，作者针对相同的59个免疫基因和肿瘤浸润淋巴细胞分别分析了TCGA队列的基底肿瘤（n = 142）和管腔肿瘤（n = 243），以研究它们在特定亚组中的重要性。 基底肿瘤中的免疫细胞簇与肿瘤浸润淋巴细胞百分比以及抗原提呈细胞标志显着相关（图4A）高免疫细胞簇有高的抗原提呈标志的表达，肿瘤浸润细胞的百分比也较高。 据报道，基底MIBC是最具攻击性的亚型，其OS较差。 但是，在图中，作者在生存分析发现患有基底肿瘤且肿瘤浸润淋巴细胞高度浸润的患者预后良好（肿瘤浸润淋巴细胞指标的多变量p <0.0001；图4B）。
（B）Kaplan-Meier回归显示基于肿瘤浸润淋巴细胞三分位数分裂（T1-T3）的生存率。生存图的左下角显示了单变量对数秩p值。 在生存曲线上方显示了通过多元Cox回归得出的整个指标“ 肿瘤浸润淋巴细胞三分位数”的p值，然后是三分位数第3组与1分位数第1组的多变量HR。表显示了三分位数拆分组，以下各栏以20个月为增量显示有风险的患者人数。
在管腔肿瘤中也存在与肿瘤浸润淋巴细胞相关的三个免疫细胞簇（图5A）。 高炎症免疫细胞簇的管腔浸润性肿瘤表现出较高的肿瘤浸润淋巴细胞浸润，而管腔乳头状肿瘤则主要被分在了低炎症免疫细胞簇和无炎症簇的基因表达（低ICC时为60％，无炎症的为85％；图5A）。 尽管管腔和管腔浸润性肿瘤被认为是侵袭性的且预后较差，但作者证明了肿瘤浸润淋巴细胞的高浸润是这些亚组中较好OS的独立预测因子（肿瘤浸润淋巴细胞指标的多变量p = 0.027；图5B ）。
图5.腔内肿瘤的TCGA-TIME（n = 243）。 （A）59个与免疫细胞炎症簇（ICC）相关的基因的无监督分级聚类，与管腔亚型，AGPS（下）和肿瘤浸润淋巴细胞％（下；比例％左）相关。下面的饼图分布显示了与ICC簇和亚型有关的TCGA腔亚型。右图显示了基于ICC群集的肿瘤浸润淋巴细胞（％）。 * = p <0.05； ** = p <0.01； *** ＝ p ＜0.001，通过Mann-Whitney检验进行了检验。 （B）Kaplan-Meier回归显示基于肿瘤浸润淋巴细胞三分位数分裂（T1-T3）的生存率。对数秩p <0.0001;指标“ 肿瘤浸润淋巴细胞三分位数”的多变量p = 0.027。生存图的左下角显示了单变量对数秩p值。在生存曲线上方显示了通过多元Cox回归得出的整个指标“ 肿瘤浸润淋巴细胞三分位数”的p值，随后是三分位数第3组和第1组的多元HR。表显示了三分位数拆分组（第一列患者总数） ），以下各栏以20个月为增量显示有风险的患者人数。
为了了解肿瘤浸润淋巴细胞在TIME升高的机制，作者测试了肿瘤细胞突变的增加是否会导致免疫系统和抗肿瘤活性识别出新的肽（新抗原）的出现。 首先，已知具有高非同义单核苷酸变体/高TMB（SNV），高APOBEC驱动的突变负担和高的新抗原负荷是延长肿瘤生存期的指标。 尽管已经针对MIBC描述了这些早期分子事件，但尚未确定这些因子与下游免疫细胞（如肿瘤浸润淋巴细胞）的直接相关性。 在图A-D中，作者在TCGA队列中的有炎症型肿瘤中发现了明显升高的非同义单核苷酸变体SNV，APOBEC介导的突变和新抗原表达（图6A-D）。 图B还显示肿瘤浸润淋巴细胞的比例在高TMB，高新抗原负荷，高APOBEC介导的突变负荷以及独特突变特征1中明显更高。 （图6B）。
图6. SNGA，SNGA中的SNV，新抗原，APOBEC突变量和突变特征的相关性。
（A）总单核苷酸变体（SNV / TMB）； log10）和新抗原负荷（log 10），以及基于整个TCGA队列中不同ICC簇的APOBEC突变负荷。
（B）在整个TCGA队列中，肿瘤浸润淋巴细胞的百分比基于三分位数组和TMB，新抗原负荷，APOBEC介导的突变负荷和独特的突变特征（MSig）。
（C-D）ICC基因簇的总SNV / TMB，新抗原负荷和（C）基础和（D）管腔亚型的APOBEC突变负荷。
PDCD1，CD274，CD3Z，CD8A和CXCL9的无监督分层聚类定义了三个免疫基因表达簇。 高免疫基因表达簇由61.9％的基底肿瘤和38.1％的管腔肿瘤组成，有较高的肿瘤浸润淋巴细胞浸润。图B显示，管腔型肿瘤在肿瘤浸润淋巴细胞含量较低的亚型中占了大多数，而大部分基质型肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞含量都较高。图C的三分位分裂分析显示，高肿瘤浸润淋巴细胞与化疗后患者的总生存期增加有关。除此之外，较高的肿瘤浸润淋巴细胞含量也与免疫细胞炎症相关基因表达增加有关（图7D）。
图7. 肿瘤浸润淋巴细胞对接受辅助化疗的患者的预后影响（n = 102）。
（A）五种免疫细胞炎症基因的无监督分级聚类，包括来自CCCEMN的69名TCGA MIBC患者和33名MIBC患者（n = 102），并接受了辅助化疗（基于铂）。免疫细胞基因簇如下所示（高，低，无），基质TIL（％）（比例％，左）和肿瘤亚型。
（B）根据肿瘤浸润淋巴细胞三分位数分裂（T1-T3）的管腔和基础亚型的百分比。
（C）基于肿瘤浸润淋巴细胞三分位数分裂（T1-T3）的辅助化疗（基于铂）的MIBC患者（n = 102）的生存期的Kaplan-Meier回归。对数秩p <0.0001;指标“ 肿瘤浸润淋巴细胞三分位数”的多变量p = 0.0001。生存图的左下角显示了单变量对数秩p值。生存曲线上方显示了通过多变量Cox回归得出的整个指标“ 肿瘤浸润淋巴细胞三分位数”的p值，接着是第3组与第1组的多变量HR。表显示了三分位数拆分组（第1列总分位数（患者），以下各列显示以20个月为增量的风险患者数。
（D）基于肿瘤浸润淋巴细胞三分分裂（T1-T3）的基因表达。
主要结论：
本研究的主要通过确定肿瘤浸润淋巴细胞在TIME中的作用，研究其具体数量和空间组织表型预测抗肿瘤的作用。
作者使用肿瘤浸润淋巴细胞和一组五个关键的T细胞特异性炎症基因，描绘出高，低或无的肿瘤炎症的表型。高炎症表型明显富集于基底肿瘤，而低炎症主要与管腔亚型有关。高肿瘤浸润淋巴细胞和炎症预示着患者生存率的提高。
接下来，IHC和CCC-EMN队列的基因表达分析揭示了免疫细胞的表型，这些表型在空间上与肿瘤浸润淋巴细胞的数量以及TLS的数量，距离和位置相关。作者确定了具有良好预后的两种炎症的表型以及一个无炎症的表型，以及具有高PD-L1 TC表达的肿瘤逃避表型，后两种均与不良预后相关。
然后作者证明了高肿瘤浸润淋巴细胞的独立生存优势。 肿瘤浸润淋巴细胞评估的预后价值与基础和EMT样表型无关。大量的肿瘤浸润淋巴细胞预测了含铂辅助化疗的益处。
肿瘤浸润淋巴细胞，TLS和免疫细胞表型以及MIBC的肿瘤亚型是患者危险分层的因素。根据作者的发现，具有未发炎和低发炎肿瘤表型且预后不良（MIBC的64％）的患者将需要替代疗法来（重新）激发免疫系统。患有发炎性高肿瘤或具有逃避表型的患者可受益于免疫检查点封锁治疗。作者的发现可能将MIBC患者治疗设计改进为个性化治疗，以获得更好的结果。
本文的局限性是仅使用OS数据来计算TCGA队列和合并辅助化疗的生存期。 在TCGA生存分析中，年龄是OS不良的最不利风险因素，这很可能是这些患者频繁，非肿瘤性特定死亡的原因。在CCC-EMN队列中，各个分析亚组中有限的生存事件可能导致了精度和功效问题。 因此，需要进行更多病例的近期研究，以进一步验证免疫表型对预后的影响。
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