易基因“微量降解甲基化测序技术”获专利授权，建库DNA低至1ng
DNA的甲基化修饰涉及动物胚胎发育、基因印迹和X染色体失活等过程，对基因的表达调控起重要作用。随着高通量测序技术的发展，全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以精确检测每一个碱基的甲基化水平，被誉为DNA甲基化检测的“金标准”。但常规基因组DNA甲基化测序前建库构建需要微克级别，至少几百纳克的无降解、无污染完整的基因组DNA，更难以应用到严重降解样品DNA的甲基化建库测序。
实际上，除了科研探索对于微量DNA甲基化技术有需求外，临床痕量样本甲基化检测技术的建立也亟需解决。体内组织DNA的提取只能采取侵入式采集，这种方式不仅操作麻烦还有可能对人体造成严重伤害。研究发现，组织来源DNA除了存在于体内，还存在于动物和人的体液中，目前在外周血、脑脊液，唾液、支气管灌洗液、胸腹腔积液、胃液、胆汁中均可检测到循环游离DNA(cfDNA)，同样可以检测到病灶组织来源的游离DNA，例如来源于肿瘤组织的循环肿瘤细胞游离DNA(ctDNA)，这为疾病的预防和控制提供了理想的检测靶标。然而临床病理检测的穿刺组织在福尔马林浸泡，石蜡包埋处理后(FFPE样本)及人体静脉外周血、粪便、尿液等分离的胞外游离DNA(cfDNA)含量极低，通常只有几纳克，且均存在严重降解的情况，部分DNA已降解到100bp以下。但对于该类样品的基因组DNA甲基化检测技术却少有报道。
近日，深圳市易基因科技有限公司开发的《一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法及其试剂盒》获得专利授权，突破了相关技术的瓶颈。该测序方法名为“微量细胞全基因组重亚硫酸盐甲基化测序(微量WGBS)”，是易基因科技自2015年开始研发的技术，于2017年申请发明专利，并于2021年获得发明授权。
专利申请只是技术的原型和起点，几年来易基因持续对方法进行优化和升级。单细胞及微量样本的DNA甲基化组学研究很大程度上受制于建库测序技术，传统的文库构建方法或类似于基因组DNA的单细胞扩增技术很难应用到甲基化实验过程中。易基因建立了基于线性扩增和单管建库的技术，可充分降低文库偏好性，准确的完成珍贵样本的全基因组甲基化研究。
微量WGBS技术优点：
① 严重降解基因组样品甲基化可检测性：基因组DNA由于降解的原因，其片段长度
显著减少。严重情况，例如FFPE样本，其片段范围可低至100bp以下，同时对于未完全片段化的样品，由于DNA双链可能部分降解，存在缺口，即使成功连接接头，在亚硫酸盐处理过程中，双链分离，也导致连接接头的DNA后续无法扩增。该技术方法在前期建库过程中，通过taq酶的扩增，可以使一条链中的缺失碱基进行扩增，同时再加入DNA连接酶，完成缺口修复，可以检测严重降解DNA的甲基化水平。
② 微量DNA(低至5ng)甲基化精确检测：传统DNA甲基化测序，亚硫酸盐处理前建库
包括末端修复、末端加A和接头连接三步。与其它方法相比，如随机延伸，可以降低实验过程中的偏好性，并在最后数据中去除建库过程中的偏好性和重复性，实现对于整个下机数据，过滤后，每一条测序reads均代表不同细胞的甲基化水平，同一基因位置的所有reads均来自于不同的细胞。DNA甲基化检测更加准确。该技术保留所有传统技术方法的优点，通过测试不同的酶组合，减少实验流程，提高各步骤反应效率，减少纯化丢失，使起始量DNA尽可能多的被检测到，达到低起始量的目的。
图示：FFPE样品A穿刺组织提取DNA片段分布2100检测结果
图示：PCR产物2100检测结果
不同样本类型（动物、植物、微生物）在微量WGBS技术中的应用选择
全样本覆盖 全基因组覆盖
微量WGBS技术的出现，解决了建库DNA低起始量、样本降解等困境，可以很好发挥其在科学研究和临床应用中的一系列优点，大大促进单细胞及微量样本DNA甲基化研究和应用。
不仅如此，易基因可以针对不同样本和研究目的，提供最优质的解决方案。在未来，易基因将继续研发、持续创新，为医学和生物学研究与应用提供更为优质的表观组学产品和服务。
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