植物与微生物在植物细胞壁的互作

DOI：https://doi.org/10.1093/Plcell/koac040

植物与微生物在质外体（植物细胞壁）的互作

Plant–microbe interactions in the apoplast: Communication at the plant cell wall

摘要

质外体指植物细胞质膜和细胞壁之间的区域，该区域是植物与微生物互作的主要场所，包含多糖，蛋白质，离子等物质，通过对该区域动态过程的研究，有利于我们的进一步了解植物与微生物之间的互作。

病原微生物根据其生活方式可以分为活体营养性、半活体营养型以及死体营养型，无论是哪种病原菌，侵染时都伴随着植物细胞壁结构松动和部分降解，释放植物细胞壁碎片、细胞外ATP和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）等等，就会徘徊在植物表面。这些原本隶属于植物的小分子（plant-derived molecules）因此形成了损伤相关的分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs），从而帮助植物识别病原菌。或者潜在的有害微生物特有的结构或化学模式，例如细菌鞭毛蛋白（bacterial flagellin epitope）flg22以及肽聚糖（peptidoglycan）。这些微生物相关分子模式也被指代为病原相关分子模式（Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMPs）。可以理解为MAMPs等同于PAMPs，此二者都能够被植物体内一类受体（pattern recognition receptors , PRRs）所识别，触发植物病原相关分子模式激发的免疫反应（PAMP-triggered Immunity, PTI），导致质外体环境发生动态变化，包括PH改变，Ca离子内流，活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生等过程发生，并引发植物的防御反应包括程序性细胞死亡、抗菌肽的分泌、致病相关(PR)蛋白和蛋白酶进入质外体，以及细胞壁（Cell wall, CW）结构修饰。

植物的分子模式识别近年来在植物抗生物胁迫领域的研究已广受关注，关于DAMP/MAMP的识别机制在其他研究中已经很清楚，本篇着重讲述植物细胞壁这个区域的识别过程。

植物细胞壁

植物细胞壁主要由纤维素，半纤维素和果胶三种物质组成，它们的聚合物赋予细胞壁一定的延展性和硬度，植物体生命活动的动态变化导致植物细胞壁在组织间具有差异性，包括组成物质的比例差异，细胞壁厚度差异。但是细胞壁的机械强度主要通过以下几个方面组成：

细胞壁的机械强度主要通过纤维素和半纤维素通过β-1,4-葡聚糖链结合形成微纤维来维持，研究病原菌侵染过程中微纤维的变化有重要意义，但目前具体变化尚不清楚。

细胞壁中另一个成分果胶（Homogalacturonan, HG），由多聚半乳糖组成，果胶单体是在细胞质中合成，并通过漆酶和过氧化物酶在质外体中聚合。首先果胶在分子结构上更易于结合纤维素以加强细胞壁结构。其次果胶被多样性修饰变成不同的果胶多糖，比如鼠李聚糖半乳糖醛酸-II，果胶被果胶甲酯酶PME（Pectin methylesterase）去甲基化，去甲基化使果胶更容易和纤维素交联，PMEI（pectin methylesterase inhibitors），果胶甲酯酶抑制剂，PME受到PH的调节，在低PH下，HG和Ca2+的结合受到抑制，细胞壁中果胶被某些酶（如多半乳糖醛酸酶）去甲基化导致结构更松动。然而去甲基化的果胶易被果胶水解酶水解，所以细胞壁的强度由果胶去甲基化决定，去甲基化的果胶可以螯合Ca2+或者被裂解酶水解所消化。

已有研究报道，一些果胶和半纤维素木聚糖会共价连接阿拉伯半乳聚糖（AGP, arabinogalactan-proteins），AGP介于多糖和蛋白质之间，具有大量糖基化程度很高的未折叠的蛋白骨架，AGP链末端的糖醛酸可以结合Ca2+，大多数的AGP通过GPI蛋白定位到细胞质膜上，但有些被释放到细胞壁。

植物细胞壁的非多糖物质主要是木质素，属于疏水性苯丙类聚合物，可以和蛋白多糖等物质交联，增强细胞壁的机械强度，但是其表达具有严格的时空特异性，在细胞受到机械损伤或病原菌侵染时在特定的组织中表达，如导管与纤维细胞。

微生物侵染对植物细胞壁的作用

细胞壁多糖降解

微生物主要通过细胞壁降解蛋白CWDE（Cell Wall-Degrading Enzymes）降解植物细胞壁多糖进而侵入细胞，CWDE的类型主要由微生物的生活方式以及侵染宿主的类型决定，微生物的生活方式主要分为活体营养型和死体营养型，一般情况下死体营养型微生物的CWDE种类更多，因为需要杀死植物细胞，所要降解的底物更复杂，最后获取营养，而不是只单纯利用细胞的初级代谢产物，病原菌主要通过突变得到多样的CWDE。CWDE和大多数水解酶的结构相似，如多糖裂解酶，糖基水解酶等，有研究表明通过敲除稻瘟菌减少CWDE种类后毒力降低，因此CWDE在病原菌侵染和定殖过程中发挥重要作用，但有研究表明部分的病原菌侵染过程不涉及细胞壁的降解，而是在裂解细胞之后的营养获取阶段，如对纤维素降解能力降低的尖孢镰刀菌通过质外体的速度反而更快，因此有些病原菌是在侵染并裂解细胞后发生对纤维素的降解。

病原菌在对植物侵染过程中也降解木聚糖，半纤维素在抵抗病原菌对木聚糖的降解发挥了主要作用，有研究表明无论是真菌（如：大丽轮支菌、稻瘟菌），还是细菌（如黄单胞菌），其木聚糖酶的突变都会导致它们的毒力降低，但对于木质素含量高的作物如小麦与大豆，敲除镰刀菌的木聚糖酶后，对该类作物毒力并没有减轻，所以木聚糖酶的活性不是侵染的主要因素，但是缺失果胶裂解酶后会导致毒性降低，比如大丽轮支菌的果胶裂解酶，青枯菌的聚半乳糖醛酸酶，马铃薯疫霉的果胶特异性LPMO的突变都会损害其毒力。

病原菌是通过降解植物细胞壁的成分进行侵染，但是植物细胞壁的降解产物易被植物识别为DAMPs，比如果胶降解产生的寡聚半乳糖醛酸，会激活植物PTI,但植物也可以精确区分部分的寡聚糖，因为来自相同聚合物的不同的寡聚糖是被不同的水解酶水解的产物，比如多数真菌分泌木聚糖酶GH12（glycoside hydrolase-12），多数细菌编码木聚糖酶GH30，这两个家族在植物基因组中不存在，植物可以区分自身GH和病菌GH的降解产物。

植物PRR对DAMP的感知是灵敏的，比如CERK1识别短的混合链状的葡聚糖寡糖和β-1,3-葡萄糖寡糖，但不识别长的β-1,3-葡萄糖寡糖，但是CERK1对MAMP的识别在不同的研究中的到了相反的结果，这对植物来说，区分病原菌和自身MAMP是关键的。病原菌为抑制植物PTI反应，试图控制植物对多糖DAMP的感知，为此，一些微生物分泌能螯合DAMP的蛋白质，阻断它们与相应PRR的结合，有研究表明CWDE也可以是MAMP。

质外体PH改变

微生物侵染过程中通过改变质外体环境的PH来削弱植物响应，植物响应DAMP和MAMP时首先发生质外体碱化，H+进入胞质，胞外PH升高，多数微生物使胞外酸化达到对宿主的定殖，如深绿木霉和拟南芥AHAs（Arabidopsis H+ -ATPases）参与质外体酸化，尖孢镰刀菌在侵染初期会导致质外体酸化，但随着时间会不断发生碱化，尖孢镰刀菌侵染主要是在碱性条件下完成的，通过分泌模拟植物的快速碱化因子实现。但这个过程中酸化和碱化转换的分子机制还需要进一步研究。

质外体PH的改变会影响细胞壁的结构，多数蛋白是受PH调节的，如膨胀蛋白、XTH（Xyloglucan Endotransglucosylase/hydrolase）、XETs（xyloglucanendotransglycosylase）、PMEs（Pectin methylesterase）和PMEIs（pectin methylesterase inhibitors）。因此，pH的下降可能会通过膨胀蛋白增强CW的松动，通过转糖基化改变水解和交联之间的平衡，或增加去甲基化HG残基片段的生成。此外，质外体PH变化也会影响纤维素和果胶物理性结合。因此，微生物对质外体pH的调节可能会改变植物与微生物CWDE和CW的修饰蛋白活性，并可能改变多糖之间的相互作用，使CW重塑更有利于微生物定殖。

Ca2+和B离子

Ca2+是PTI的第二信使，当PRR被磷酸化时胞外Ca2+内流进入胞质，液泡等细胞器Ca2+也进入胞质，Ca2+依赖的激酶（CDPK）被激活，激活下游免疫，不同的CDPK对Ca2+亲和的浓度不同。除了游离的Ca2+，AGP结合的Ca2+是受PH调节的，从而影响多糖交联。

微生物要阻止Ca2+内流建立定殖，如细菌细胞壁含有黄原胶，带负电，和Ca2+螯合，阻止其内流，抑制拟南芥免疫；根瘤菌与植物根毛建立寄生关系过程中，Ca2+和其他二价阳离子都起着重要的作用，这些细菌的酸性细胞外聚合物（EPSs- extracellular polymeric substances) 螯合质外体Ca2+，从而使EPSs凝胶化，成为将微生物黏附在植物表面的“胶水”。有研究报道除了微生物多糖与Ca2+结合外，一种Ca2+结合蛋白rhicadhesin还参与细菌与根的非特异性附着。

B和Ca2+一起参与细胞壁的结构稳定，缺硼会导致细胞壁结构破坏，有研究报道，土壤中硼的累积负调节微生物多样性，且对细菌的影响大于真菌，植物与微生物互作过程中，硼是否发挥直接作用还尚不清楚，但硼的缺乏和过量积累对植物与微生物互作都有影响。

植物细胞壁防御的增强

面对病原菌侵染，植物主要从三个方面增强防御：首先是产生ROS和木质素，ROS作为毒性因子对抗病原菌，作为信号分子激活免疫，诱导胼胝质沉积以及木质素的累积，形成限制病原菌扩散的物理屏障，胼胝质在抵抗病原菌的具体机制还不清楚，可能增强细胞延展性，减少了病原侵染过程中产生的脆性断裂，也可能填充细胞壁孔隙限制效应因子的通过；真菌细胞壁含有β-1,3葡聚糖，胼胝质含有大量β-1,3葡聚糖，细胞壁的胼胝质很有可能会被真菌识别为自身的物质下调毒力因子，影响真菌行为，这些观点还需要进一步研究考证。

为了抵抗病原菌，植物通过增加细胞壁修饰蛋白表达，增强细胞壁强度，通过蛋白质抑制剂影响病原菌蛋白的释放。

木质素沉积是植物对抗病原菌扩散的普遍方式，CASP（The Critical Assessment of protein Structure Prediction）蛋白和NADPH共同促进木质素的沉积，CASP蛋白作用于凯氏带，凯氏带则在根中充当着扩散屏障，病原体诱导的木质化可能类似于凯氏带的形成，通过空间限制能够防止入侵的无毒病原体的扩散。

木栓质具有组织表达特异性，一般发生于种皮，叶表皮细胞，周皮，或在受伤和微生物侵染时特异合成，一般被位于导管的病原体诱导合成，有研究报道植物与微生物互作过程中，木栓质受到转录因子MYBs的调控，了解木栓质和蛋白在细胞壁中的组装也很重要，这可能是通过与角质合酶结构相似的酶，以酯交换反应完成的；此外，在植物定殖过程中，微生物对木栓质的降解还不太清楚，尽管已经鉴定出各种木栓素酶，但还需要进一步研究。

总结和展望

本文通过介绍植物细胞壁的结构组成，站在植物细胞壁动态生化过程的角度，分别从植物和微生物两方面论述它们之间的互作，包括细胞壁被侵染时发生的修饰作用，微生物破坏细胞壁的方式，以及植物进一步响应微生物侵染而增强防御的过程。

植物细胞壁是个动态变化过程，其性质随着细胞壁的修饰，离子组成，新物质合成而改变，这些变化尤其在植物与微生物相互作用时变得活跃，对植物CW在宿主-微生物相互作用中的研究主要集中在单个CWDE在致病中的功能重要性，CWDE产物作为DAMP的作用，以及合成新的CW物质进行防御，这些仍有待研究，例如，新的CW衍生的DAMP已被鉴定，其受体未知，许多质膜受体已被报道影响植物抗病性，但其配体和/或在植物防御中的确切作用尚未得到表征。蛋白质组学技术也可进一步发挥作用，如空间蛋白质组学和磷酸蛋白质组学，已鉴定对疾病或特定信号有反应的受体和信号传导成分。此外，植物对其自身CW衍生的DAMP和微生物产生的DAMP的反应是如何区分和协调还需要研究。植物CW多糖和离子的动态变化，这些问题还需以更精确的时空表达监测研究植物与微生物之间的相互作用，例如在不同的细胞层和细胞区域。

图1 细胞壁多糖之间的交联

未受侵染的细胞壁结构模型。基于洋葱表皮CWs的原子力显微镜图像:纤维素微原纤维(蓝色原纤维)嵌入果胶(黄色链)、半纤维素(绿色链)、阿拉伯半乳聚糖蛋白(粉红色显示线性蛋白骨架，橙色显示糖基化羟基脯氨酸残基)和其他植物CW蛋白(粉色)。红色阴影的地方，被称为生物力学热点，可能对连续化学力学有不同的贡献，可能包括纤维素和其他分子之间的接触点。纤维素微原纤维在质膜上由纤维素合酶复合物沿着微管轨迹合成，而其他多糖则在高尔基体中合成，在质外体中组装。

A:木聚糖通过氢键与纤维素微原纤维的亲水性表面结合

B:在分子动力学模拟的基础上，木葡聚糖与纤维素的疏水性表面结合，尽管这种相互作用的细节需要进一步研究。这种相互作用被EXP和XTH/XETs修饰。EXP疏松蛋白它通过一种未知的机制导致连续松动，可能是通过分离相互作用的半纤维素和纤维素。XTH将木葡聚糖链糖基化转到纤维素的葡聚糖链上，形成一个新的共价键，用红色突出显示。这也可以使木葡聚糖-木葡聚糖连接，或水解木葡聚糖

C:HG被PMEIs抑制的PME去甲基化，从而调节果胶的甲基化状态。被PME脱除甲基的区域结合Ca2 +(紫红色圆圈)，形成二聚化的蛋盒结构，无论是在分子内还是分子间。Ca2 +结合的果胶似乎与纤维素有关，尽管这种相互作用的细节尚不清楚。去甲基化HG的大小通过PLs和PG的裂解而缩短。

D:阿拉伯半乳糖蛋白暴露的葡萄糖醛酸残基 可以结合Ca2 +，这可能导致了二聚化

然而，除了多糖之间，其他的物质相互作用及其与连续多糖之间，特别是整个细胞或组织的涌现特性的关系的内聚模型还在探索中。这与植物与微生物的相互作用有很大联系，所以我们需要了解CW的特性和结构如何与病害发生相关。

图二:微生物侵染对植物细胞壁的修饰作用

微生物定殖后植物CW环境的改变，图一是微生物对细胞壁的修饰

A：植物CW多糖在微生物酶活性的作用下被消化。一些产生的寡糖片段被质膜定位受体检测为DAMP，该受体诱导导致防御反应的信号级联。显示了已证实的DAMP，如纤维二糖和OGs，以及潜在的DAMP

B:微生物通过调节PH木葡聚糖酶（GH12）和EXP切割木葡聚糖松动细胞壁

C:果胶酸酯，PLs,PGs把聚合物切割为小片段时，微生物PMEs去除了果胶的甲基，在低PH值下或有HG小片段存在时，果胶失去和Ca2+结合的能力，可能降低了果胶和细胞质膜之间的联系。

D:响应尖孢镰刀菌接触而过度激活植物质膜质子ATP酶（AHAs），导致细胞膜中纤维素合酶复合物的耗竭和皮层微管解聚。这导致纤维素合成停止，可能是对病原体感染的一般反应，尽管迄今为止只在尖孢镰刀菌中观察到。

E:质外体pH的下降导致阿拉伯半乳聚糖蛋白和HG释放Ca2+离子，这可能对响应微生物检测到的胞质Ca2+峰值有重要贡献。释放的Ca2+可以被细菌胞外多糖螯合，影响对激活植物免疫很重要的Ca2+动力学

F:为了应对一些微生物的攻击，植物细胞形成由纤维素、胼胝质（紫色链）、PR和具有抗菌特性的次级代谢产物组成的乳头。乳头多糖以未知的方式相互作用，尽管老茧在体外改变了纤维素凝胶的延展性

G:植物细胞通过PRX和LACs的活性通过木质化（浅棕色链）增强其CW。PRX与脱甲基HG结合，这可能有助于在CW损伤位点定位木质素的形成。一些微生物被困在新形成的木质素网络中。微生物可以通过其细胞外聚合物清除ROS。所示的许多模型都是推测性的，基于相关背景下的研究（C、D、F和G）或已知的酶活性（E和F）

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