J Cell Mol Med | STRN3 通过抑制 Hippo 通路促进肝细胞癌的生长

导语

结果：

STRN3的高表达与HCC患者的预后不良相关。

根据STRN3表达水平，对371例具有临床和病理特征的HCC患者进行了排序。图1A展示了年龄、性别、种族、诊断、TNM和肿瘤分期的不同属性。性别对STRN3表达有轻微影响，女性肿瘤组织中的STRN3富集水平高于男性（p = 0.003）。此外，STRN3表达与肿瘤分期有关，处于晚期（III期）的患者STRN3表达水平较高（p = 0.008）。至于被诊断为IV期的患者，纳入人数较少，可能对统计结果产生一定影响。另一方面，作者观察到白人患者肿瘤组织中STRN3的表达水平高于非洲裔美国人患者，并且与肿瘤状态有关（p = 0.039）（图1B）。为进一步研究STRN3表达与患者生存之间的关联，作者根据STRN3的中位表达水平将371例HCC患者分为高表达组和低表达组。Kaplan-Meier生存曲线显示，STRN3表达较高的患者的总体生存率（OS）结果明显较差，相比之下，STRN3表达较低的患者（p = 0.025）（图1C）。为了验证这些发现，作者还分析了肿瘤组织和正常肝组织的RNA-seq数据。GEO数据（GSE65372，p = 0.008）和（GSE144269，p = 0.028）都证实了HCC组织中STRN3表达较高，而癌旁肝组织中STRN3表达较低（图1D，E）。此外，来自Human Protein Atlas数据库的免疫组化染色样本显示了正常和癌组织中STRN3的表达模式，并显示STRN3主要定位于细胞质和核质（图1F）。

STRN3在HCC的转录调控过程中起着重要作用

为了确定与HCC中STRN3最相关的基因，作者使用来自TCGA数据库的371名HCC患者的数据进行了皮尔逊相关性分析。根据结果，作者进行了GO和KEGG分析，以进一步探索STRN3的生物功能。

作者的研究结果显示，与STRN3最相关的分子功能（MF）是蛋白质结合（图2A），这与先前的研究一致。STRN具有几个结合区域，包括保守的洞窟蛋白结合（CAV）区域，螺旋卷曲区域，钙调蛋白结合区域，CCM3结合区域和C端WD40重复区域。这些功能区域使STRN3能够结合信号分子或特定蛋白质，使其成为信号转导的重要调节因子。生物过程（BP）分析表明，染色质重塑与STRN3最相关（图2B）。染色质重塑意味着染色质的位置和结构发生变化。核小体在DNA上的滑动，甚至组蛋白和其变异体之间的去除或交换是其潜在原因。据报道，这个过程主要由染色质调节因子（CRs）调控，它们被认为具有影响显著基因表达和失活变化以加速疾病进展的能力。11 ， 12 此外，具有特定结构域的某些蛋白质，如WD40重复序列，也可以参与染色质修饰， 13 这意味着STRN3可能具有调节染色体的潜力。GO细胞组分（CC）分析显示，STRN3主要分布在核浆和细胞质中（图2C），与免疫组化结果一致。KEGG分析显示，STRN3与转录调控失调在癌症中最相关的信号通路（图2D）。先前的研究表明，STRN3作为PP2A的调节亚单位，影响YAP-Hippo轴的激活。8 ， 14 然而，目前尚不清楚STRN3是否可以通过其在HCC中的多个蛋白质结合位点来调节Hippo或其他信号通路，这需要进一步研究。根据作者的结果，作者推测STRN3很可能参与转录调控的生物过程，并可能进一步影响HCC的发展。

STRN3敲低抑制了肝细胞癌的细胞增殖、侵袭，并诱导了细胞凋亡

为了研究STRN3在HCC中的生物功能，作者确定了其在六种HCC细胞系中的表达水平。作者的结果显示，STRN3在Huh7细胞中高表达，在PLC细胞中低表达（图3A）。然后，作者使用siRNA来抑制Huh7细胞中STRN3的表达，同时在PLC细胞中进行STRN3的过表达。然后，作者使用qRT-PCR和Western blotting确认了抑制和过表达的效率（图3B、C）。siRNA#2和siRNA#3被选中进行进一步的细胞功能实验。CCK8和克隆形成实验表明，STRN3的抑制显著抑制了Huh7细胞的增殖，而在PLC细胞中过表达STRN3后，它们的细胞增殖能力显著增强（图3D、E）。此外，侵袭和划痕愈合实验显示STRN3与细胞迁移能力相关。抑制STRN3可以抑制细胞迁移，而过表达STRN3后，PLC的侵袭潜力明显增强（图3F、G）。细胞凋亡实验还显示了STRN3与细胞存活状态之间的密切相关性，STRN3的下调显著促进了细胞凋亡（图3H）。这些结果共同表明，STRN3在HCC细胞增殖和抗凋亡中起着重要作用，以一种保护性的方式促进肿瘤进展。这与作者之前从TCGA数据库分析得出的结论一致，即肿瘤组织中STRN3的高表达与HCC患者的不良预后相关。

STRN3是HCC中Hippo信号通路中的一个重要的上游调控分子

YAP蛋白的表达和细胞内分布在Hippo信号通路的激活中起着关键作用。随后，作者通过Western blot分析了Hippo通路中的关键蛋白，包括MST1/2、YAP以及它们的磷酸化水平。结果显示，在Huh7细胞中，STRN3蛋白表达的沉默并没有显著影响MST1和YAP的表达水平。然而，它显著增加了YAP和MST1/2的磷酸化水平，表明STRN3是Hippo信号通路中的一个重要上游调节分子。STRN3表达的下调可以促进Hippo通路的激活，而过表达STRN3后，YAP和MST1/2的磷酸化水平降低，表明Hippo通路被抑制（图4A）。此外，作者进行了细胞免疫荧光实验，发现在对照组中，YAP蛋白主要定位在细胞核中。然而，在沉默STRN3蛋白后，YAP蛋白分散在细胞质中（图4B）。YAP蛋白定位的改变进一步证实了STRN3可以调节YAP的细胞内定位，从而控制Hippo通路的激活状态。作者接下来利用TCGA数据库对STRN3、YAP和YAP靶基因CCN1和CCN2进行相关性分析。结果显示STRN3与YAP之间存在显著相关性（R 2 = 0.239, p < 0.0001），同时STRN3与YAP靶基因之间也存在明显的正相关性（CCN1: R 2 = 0.043, p < 0.0001；CCN2: R 2 = 0.067, p < 0.0001）（图4C,D）。此外，作者还对STRN3敲除或过表达细胞中CCN1和CCN2的表达进行了评估。结果显示STRN3敲除导致CCN1和CCN2的表达显著下降，而STRN3过表达则导致CCN1和CCN2的mRNA水平明显增加（图4E）。综上所述，基于上述发现，作者得出结论：STRN3能够有效调节YAP的转录活性。这些发现进一步证明了STRN3在调控Hippo通路中的重要性。

HCC 细胞中 STRN3 和 YAP 的表达分布和丰度

为了全面描述 STRN3 和 YAP 在 HCC 中的相关性，作者分析了来自 NCBI Geo DataSets 的单细胞 RNA（scRNA）测序数据。作者使用主成分分析和统一流形逼近和投影（UMAP）进行聚类和数据降维。最终，所有细胞被分配到 8 个不同的细胞类型（图 5A），具有特定的标记物：EPCAM、ALDH1A1 和 ALB 用于上皮细胞和肿瘤细胞；CD79A 和 MS4A1 用于 B 细胞；CD3D 和 CD3E 用于 T 细胞；FGFBP2 用于自然杀伤细胞（NK 细胞）；ITGAM、CD33、CD68、CD14 和 CD163 用于单核细胞和巨噬细胞；ITGAX 用于树突状细胞；ACTA2 和 COL1A2 用于成纤维细胞；PECAM1 用于内皮细胞（图 5B）。上述每个细胞簇中特定标记物的表达情况在附图 S1、S2 中显示。接下来，我们将上皮细胞和肿瘤细胞簇进行进一步分析（图 5C）。ALB 用于定义肝细胞，AFP 用于定义 HCC 细胞。通过检查 STRN3 在不同簇中的表达分布，我们发现 STRN3 在簇 0、1、2、4 和 5 中富集，与 YAP 的丰度和分布相似。此外，我们观察到 STRN3 和 AFP 的分布范围存在显著重叠（图 5D，E）。为了进一步验证生物信息学分析得出的结果，作者对肝细胞癌患者的肿瘤组织进行了多重免疫荧光实验。可以清楚地观察到细胞中 STRN3 和 YAP 的共表达，并且结果表明这两种蛋白质的表达存在显著相关性（图 5F）。这些结果表明 STRN3 和 YAP 在细胞水平上存在密切相关，并且 STRN3 在肝细胞癌细胞中的表达显著增加。

STRN3 在肝癌组织中上调，并与预后不良相关

作者收集了一小组 HCC 患者，并对肿瘤和相邻非癌组织中 STRN3 的 mRNA 和蛋白表达进行了测试。通过实验，作者发现这 24 名肝癌患者相邻组织中 STRN3 的 mRNA 表达显著低于肿瘤中的表达（图 6A）。此外，作者使用 Western blot 检测了 6 名患者的癌症和相邻非癌组织中 STRN3 蛋白的表达。结果直观地证明相邻组织中 STRN3 的表达明显较弱（图 6B）。

总结

然而，作者的研究仍存在一些限制。首先，作者尚未阐明 STRN3 如何影响 MST1/2 和 YAP 磷酸化的具体机制，以及 STRN3 敲除是否会影响 PP2A 和 STRIPAK 复合物的结构和功能。其次，作者尚未进行动物实验来证明 STRN3 对体内肿瘤发展的影响。第三，参与研究的 HCC 患者数量不足，且其预后生存时间不够长。在 STRN3 的未来研究中，作者将解决这些问题，并进一步详细研究 STRN3 在 HCC 中的生物学作用，以提高本研究的准确性。

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