科研 | Food & Function：宏基因组学揭示了枣多糖在小鼠结直肠癌模型中的干预效应（国人作品）

编译：吴军，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

结直肠癌（CRC）是一种严重的全球公共卫生疾病，在世界上，它在女性中是第二常见的癌症，在男性中是第三常见的癌症。流行病学研究表明，该疾病可能由食用大量加工肉类（西方饮食）引起，这种饮食习惯造成了饮食摄入和能量消耗之间的不平衡。因此，现在人们更加关注潜在的抗结肠癌天然植物产品。

在我国，红枣果实是被公认为具有较高营养和药理作用的食品。红枣干被广泛用作食品、食品添加剂、调味品和中药，已有数千年的历史。在药用层面，红枣具有减肥、抗癫痫、抗失眠、神经保护、抗氧化、抗炎、抗癌等功效。红枣多糖（JP）是红枣果实中含量最丰富的成分，并可能与其化学预防特性（如免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、肝保护和低血糖活性以及胃肠道保护作用）相关。已有研究表明，口服JP能有效地缩短胃肠道转运时间，降低盲肠氨水平。在仓鼠模型的不同肠道和粪便指数中，JP造成盲肠中总短链脂肪酸（SCFA）浓度升高，粪便水分增加，粪便中氨的日输出量减少。此外，在使用偶氮甲烷（AOM）和葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导大肠癌小鼠模型中，野枣多糖可以保护小鼠免受实验性炎症性肠道损伤。总之，虽然红枣多糖在动物模型中已被证明具有抑制癌变的作用，但是其预防肿瘤发生的分子机制尚不清楚。

近些年，越来越多的证据表明肠道微生物群在结直肠癌的发生和发展中起着重要作用。为了探究肠道微生物是否介导了枣多糖的抗癌作用，本研究利用AOM/DSS诱导的结肠炎小鼠模型，对小鼠粪便进行宏基因组测序，分析了JP对肠道菌群结构的影响。结果表明：

1）与对照组相比，JP的加入可改善结肠炎癌引起的肠道菌群失调，从而达到预防结肠癌的目的；

2）JP治疗后厚壁菌/拟杆菌比值显著减少；

3）在JP干预13周后，KEGG信号通路中的代谢途径、ATP结合盒（ABC）转运体和双组分系统富集了最多的差异表达基因；

JP通过积极调节肠道微生物群落和影响某些有助于宿主健康的代谢途径而表现出益生元样活性。

论文ID

原名：Metagenomicanalysis of gut microbiota modulatory effects of jujube (Ziziphus jujubaMill.) polysaccharides in a colorectal cancer mouse model

译名：枣多糖干预效应在小鼠结直肠癌模型中的宏基因组学分析

期刊：Food& Function

IF：3.241

发表时间：2019年12月9日

通信作者：闫溢哲&国旭丹

通信作者单位：郑州轻工业大学食品与生物工程学院&河北中医学院基础医学院

实验设计

实验动物为约6-8周龄雄性C57BL/6小鼠，体重约20克。致癌物AOM和致炎剂DSS用来诱发小鼠结肠癌，在第0天进行一次AOM腹腔注射，一周后，在小鼠饮用水中加入2.0%-2.5%的DSS，连续7天，接着是14天的正常饮用水，这个周期重复两次（图1A）。JP组AOM/DSS诱导的小鼠按照1000 mg·kg-1每天灌胃 JP一次，对照组（C）仅用无菌生理盐水灌胃，一直从第0天进行到研究结束。在整个实验过程中，每周记录一次体重。在第13周结束时，用颈椎脱位处死所有小鼠，切除从回盲交界到肛门的整个结肠。记录结肠长度，然后用10%磷酸盐缓冲福尔马林固定样品进行组织病理学检查。

实验结束后，收集每组小鼠的粪便样品，提取DNA进行宏基因组测序分析。

结果

1 JP对AOM/DSS诱导的结肠炎和结直肠癌具有抑制作用

为了检测JP在大肠癌小鼠模型中的作用，用诱变剂AOM诱发结肠肿瘤，然后用三倍剂量的DSS诱发慢性炎症（图1A）。单独接受生理盐水的小鼠作为对照组，AOM/DSS诱导后，JP组小鼠口服1000mg·kg^-1 JP，每天1次，连续13周。结果显示，与对照组相比，AOM/DSS诱导的小鼠体重显著下降，到研究结束时，JP治疗明显缓解了这种情况（图1B）。在没有JP治疗的情况下，AOM/DSS诱导的小鼠在其结肠中表现出高肿瘤负荷，而JP治疗显著降低了AOM/DSS诱导的肿瘤（图1C）。此外，与对照组相比，AOM/DSS诱导的小鼠结肠长度减少，这种显著的长度减少随后通过JP治疗得到缓解（图1C）。采用苏木精-伊红染色对AOM/DSS诱导的结肠进行病理学分析，结果表明，JP可减少肿瘤的数目和大小，对AOM/DSS引起的不典型增生/腺癌的表面坏死有保护作用。这些结果表明，JP对AOM/DSS诱导的结肠炎和结直肠癌具有较强的抑制作用。

图1 在C57BL/6小鼠中评价JP对结肠炎相关结肠癌发生的影响

（A） AOM/DSS和JP处理小鼠的示意图；（B）AOM/DSS治疗后的体重减轻曲线；（C）小鼠结肠的显微镜观察。AOM/DSS治疗可使结肠肿瘤的发生率达100%；（D）结肠苏木精和伊红染色。

2 JP对肠道菌群多样性的影响

所有样本中经数据过滤后的高质量序列的比例均大于98.50%，表明粪便微生物群基因分析的测序深度良好（表S1）。使用MEGAHIT软件组装有效序列，组装结果中每组的N90均为600bp以上（表S2）。利用NCBI的ReefSeq数据库，检索粪便微生物基因，并用Meta-Othello对物种进行注释。对每个样本的物种注释和丰度信息进行计数，获得物种丰度信息表（图2）。在不同类群的可分类序列中，蛋白质细菌、厚壁菌、拟杆菌、放线菌、子囊菌和担子菌是样品中的优势菌系。Venn图显示，所有样本共有1579444个OTU（图S1c），在AOM/DSS处理的小鼠喂食JP后，大约造成43.68%的OTU减少。

图2 AOM/DSS诱发大肠癌小鼠模型粪便微生物区系分类

在各个实验组中，最丰富的门包括蛋白质细菌、厚壁菌、子囊菌和拟杆菌。其他种类的细菌丰度相对较低，如粘液菌科、螺旋体、疣状芽胞杆菌、蓝藻和一些未分类细菌（图3A）。JP处理后，拟杆菌的相对丰度显著增加，而厚壁菌的相对丰度显著减少。此外，JP组中拟杆菌与厚壁菌的比例（B/F）从0.27（M）增加到0.39（JP）。为了调查不同鼠群中的粪便微生物群落，进行了科水平上的分析（图3C）。在这一水平上，JP治疗期间，乳杆菌科、拟杆菌科和德巴利酵母科有增加的趋势（P<0.05）。乳杆菌科是JP治疗期间家系水平上的优势有益菌，其相对丰度在第13周从0.010显著增加到0.017。拟杆菌科的相对丰度呈相似趋势，JP组13周后的相对丰度为0.022，M组为0.015。干预13周后，黑酵母菌科、肠杆菌科、曲霉科和漆霉科的数量减少。拟杆菌和厚壁菌的丰度变化趋势在门的水平上是相似的。

图3 不同实验组小鼠粪便微生物在门（A）、属（B）和科（C）水平上的相对丰度和柱状图

在属水平上，当喂食JP 13周时，拟杆菌和放线杆菌数量增加，而厚壁菌、蓝藻、去铁杆菌、螺旋体和粘杆菌的相对丰度显著降低。这些结果表明，JP处理可明显减轻AOM/DSS引起的肠道菌群失调，属于两个优势门的某些属可作为鉴别生物标志物。尽管JP干预13周后个体间变异性很高，但与M组相比，厚壁菌明显较少，而拟杆菌在粪便微生物群中明显较多。为了观察不同组别微生物群落之间的相似性，进行了主坐标分析、主成分分析和非度量多维标度分析（图S1b）。尽管同一组内存在显著的个体间差异，但用这些不同的分析方法可以明显地分离出喂食JP的AOM/DSS诱导小鼠的粪便微生物群。以上这些结果表明了喂食JP降低了微生物群落多样性和病原菌水平，但是增加了益生菌的多样性。

3 JP对肠道菌群的影响

每个样本中KEGG相对丰度的估算用于预测添加JP的微生物组的代谢功能变化（图4）。KEGG途径分析表明，膜转运、碳水化合物代谢、脂质代谢以及萜类和聚酮类化合物的代谢占富集程度最高的前五位。在JP组与M组之间，JP组的翻译、核苷酸代谢和细胞运动富集程度最高。

图4 利用宏基因组估算各组间代谢差异（A）M和JP之间，（B）C和M之间，（C）C和JP之间。利用STAMP分析了每个输入样本宏基因组中编码的代谢途径的相对丰度。

13周后，JP相关的差异表达基因在不同的KEGG途径中富集，这些基因涉及代谢、ATP结合盒（ABC）转运体和双组分系统（图5），其中ABC转运体包括参与糖和氨基酸的转运体。此外，喂食JP 13周后，C组和M组、C组和JP组之间的差异表达基因（图S2）主要集中在双组分系统中。

图5 M组和JP组间差异表达基因的KEGG分析

GO数据库为描述基因产物的不同功能提供了三种不同类型的系统定义。GO功能包括生物学过程、细胞成分和分子功能。生物过程由多步骤的分子功能组成，细胞成分是指位于细胞器中的基因产物，而分子功能则是指分子的生物活性，如催化和结合活性。对于每个GO功能，作者选取了七个富集程度最大的GO号。对M组和JP组差异表达基因的GO分析表明，大多数基因位于生物学过程组，包括代谢过程、细胞过程、单体生物过程、定位、生物调控和生物过程调控。M组和JP组的差异表达基因在细胞成分组中包括膜、细胞、细胞部分和膜部分，在分子功能组中包括催化活性、结合、转运活性和核酸结合转录因子活性（图6）。图S2显示了C组和M组以及C组和JP组之间差异表达基因的GO分析，不同组之间差异表达基因的数量表明了显著差异的程度。

图6 M组和JP组间差异表达基因的GO分析

讨论

结直肠癌及其相关的并发症是影响人类健康的主要疾病，结直肠癌伴随着高死亡率和成人发病率，是全球第三常见的癌症。因此，实施无副作用的饮食方案来预防结直肠癌成为了一项公共卫生目标。

多糖是枣果中的主要成分，具有显著的肠胃保护作用，包括促进组织修复、调节肠道微生物和产生抗炎作用，先前的研究表明JP通过降低肿瘤坏死因子α、IL-1b、IL-6和髓过氧化物酶的活性来减少大鼠的炎症反应， JP还可以激活AMPK增强肠屏障功能来保护炎症性肠病。然而，由于生物利用度低，JP不能完全被胃肠道吸收。在以前的研究中发现，JP可以被结肠细菌降解为低聚糖和SCFA。这些SCFA和低聚糖与结肠中的微生物群相互作用，其产生的代谢产物除了调节微生物种群外，似乎还影响肠道微生态。

人类肠道被视为生物反应器，在那里植物多糖和肠道微生物之间发生相互作用。低聚糖类益生元是不易消化的食物成分，它们主要通过刺激特定肠道细菌的生长和活性而使宿主受益。据报道，某些具有益生元样活性的植物多糖对肠道微生物群落有重大影响，这些益生元有助于重建健康的肠道微生物群落。在之前的研究中，JP表现出与低聚果糖类似的效果，它们能促进有益细菌的生长，包括双歧杆菌属和乳酸杆菌。此外，它们对肠杆菌、嗜臭杆菌、瘤胃杆菌、厌氧菌和布劳特氏菌群有抑制作用。有报道称，黑酵母菌科、肠杆菌科、曲霉科和毛螺旋菌科能够促进肿瘤的发生，而双歧杆菌和乳酸杆菌/肠球菌能够降解大分子植物多糖，具有抗炎和抗肿瘤的特性。利用AOM/DSS小鼠模型，作者研究了JP对肠道菌群的调节作用。JP对AOM/DSS诱导的大肠癌有明显的保护作用，并且能调节微生物菌群失调和维持平衡。拟杆菌和厚壁菌是参与未消化植物多糖结肠代谢的主要菌群，人们普遍认为，在JP治疗后，拟杆菌/厚壁菌的比例增加可以防止小鼠CRC模型中CRC的发展，从而调节肠道微生物群。AOM和DSS的喂养不仅影响肠道形态、粘蛋白产生、肠道通透性和SCFA的产生，而且还可能促进菌群失调。在本研究中，通过JP干预，我们观察到大鼠CRC模型中的厚壁菌数量大幅度减少，拟杆菌和蛋白菌数量增加。这些结果与之前的报告一致，表明厚壁菌在很大程度上受到植物多糖及其代谢产物的抑制，从而使肠道中的平衡向拟杆菌倾斜。

膳食多糖可引起特定微生物种群的变化，而微生物对多糖的转化影响其他结肠途径和过程，如SCFA的产生。SCFA的产生是肠道微生物群代谢的结果，它们的比例和浓度受肠道菌群和饮食的显著影响。产生SCFA的细菌可以促进植物多糖的能量摄入，并预防宿主结肠疾病，如CRC。酸性结肠环境对病原菌有保护作用，有助于矿物质的吸收，高水平的醋酸可能与双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌和肠球菌的代谢活性有关。在本研究中，在门的水平上，JP干预后拟杆菌数量显著增加，可能与醋酸的产生有关。粪便杆菌和玫瑰囊菌与丁酸盐的产生密切相关，它们也平衡了肠道菌群的失调。在本研究中，它们的相对丰度随着JP的摄入而降低。已知丁酸产生菌属于厚壁菌门，但其他门可能有潜在的候选菌，如放线菌和蛋白质细菌。众所周知，SCFA是碳水化合物代谢的主要终产物，它能抑制肿瘤细胞的增殖，保护肠道免受结肠炎和结直肠癌的侵袭，大多数分类群与粪便中的丁酸浓度呈正相关，且这些丁酸大多来自厚壁门菌。

越来越多的临床前证据表明，JP对多种涉及信号转导途径的人类疾病具有潜在的治疗作用。因此，这种无毒的天然药物无论是单独使用还是与传统疗法结合使用，都非常有助于预防人类慢性病。在抗结肠癌方面，先前的研究表明JP的积极影响可能来自其抑制慢性炎症和氧化应激损伤的能力。然而，JP对结肠癌机制的影响尚不清楚。

在我们的研究中，对差异表达基因的GO分析表明JP干预影响了细胞组分基因，包括胞质溶胶中的那些基因，细胞质、质膜、膜及膜的组成成分，减轻AOM/DSS诱导的不良后果。对于不同组的KEGG相对丰度的估算，在排泄系统、转录和物质依赖性方面观察到最大的统计差异。然而，对于差异表达基因的KEGG途径分析，不同组分的排名不同；代谢途径、ABC转运体和双组分系统在M组和JP组中富集程度最高，这些结果表明JP治疗对这些途径有显著影响，值得进一步研究。

结论

在本研究中，枣多糖对AOM/DSS诱导的大肠癌具有明显的保护作用。在维持微生物生态平衡方面也表现出了很强的活性。这些结果表明，枣多糖干预不仅有利于某些肠道菌群的稳定性，特别是在微生物失衡引发的环境中，而且还影响关键代谢途径，有助于维持宿主肠道健康。

本文的研究思路及研究方法较为清晰，采用了常规的方法去观察了不同组间的微生物结构变化情况、KEGG以及GO富集分析，其结果印证了前人的观点，也为后续机制探究提供了一些思路。可惜不足的是，该研究旨在探究枣多糖抑制肠癌发生的机制。

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