编译：微科盟橙子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
微科盟原创微文，欢迎转发转载。
导读不断上升的大气二氧化碳浓度正在导致海洋酸化，对海洋生物造成严重后果。由于二氧化碳对光合作用是必不可少的，因此升高的二氧化碳对浮游植物的影响更为复杂，其机制目前还不清楚。在本研究中，我们应用RNA-seq和iTRAQ蛋白质组学研究了CO2增加（从~400到1000 ppm）对温带沿海玛氏骨条藻的影响。我们从高CO2条件下鉴定了32389个差异表达基因（DEGs）和1826个差异表达蛋白（DEPs），分别占总基因的48.5%和总蛋白的25.9%。pCO2的升高显著抑制了玛氏骨条藻的生长，组学数据表明这可能是由于叶绿体光合作用受损和线粒体能量代谢增强所致。此外，许多与氮代谢、转录调控和翻译调控相关的基因/蛋白质显著上调，表明蛋白质合成增强。此外，玛氏骨条藻具有较高的活性氧生成能力和抗氧化能力。总的来说，升高的pCO2似乎抑制了玛氏骨条藻的光合作用和生长，并通过大量的基因表达重组诱导细胞增加蛋白质合成、能量代谢和抗氧化应激防御，可能维持pH稳态和种群存活。这种生存策略可能会剥夺这种通常在温带沿海水域占优势的硅藻在酸化环境中的竞争优势。
原名：Integrated RNA-seq and Proteomic Studies Reveal Resource Reallocation towards Energy Metabolism and Defense in Skeletonema marinoi in Response to CO2 Increase译名：综合RNA-seq和蛋白质组学研究揭示了玛氏骨条藻对CO2增加的能量代谢和防御的资源再分配
期刊：Applied and Environmental Microbiology
1. 首先测定玛氏骨条藻的生长速率和pH值变化；
2. 利用转录组学注释玛氏骨条藻中基因，且利用iTRAQ定量蛋白质组测定蛋白质含量变化；
3. 然后针对氮代谢相关基因和碳代谢活性相关基因进行深入分析；
4. 最后研究玛氏骨条藻调节代谢的分子机制。
在5天的实验期间，环境CO2和高CO2处理组的生长趋势相似，最大细胞密度分别为每毫升（4.64±0.03）×106和（4.05±0.07）×106个细胞（单向方差分析，P<0.01）（图1A）。在环境CO2条件下，玛氏骨条藻的内禀生长速率（μ）为0.96±0.002 d-1，而在高CO2条件下，玛氏骨条藻的内禀生长速率（μ）为0.92±0.004 d-1。两组的最高生长速率出现在第1天，分别为1.57±0.02 d-1（环境pCO2）和1.52±0.08 d-1（升高pCO2）（单因素方差分析，P>0.05）。我们注意到，在处理环境CO2和升高的CO2时，pH值的波动是不同的。随着细胞密度的增加，从第1天到第5天，环境CO2下的pH值逐渐升高，而升高CO2下的pH值在此期间略有下降（图1B）。
图1 玛氏骨条藻细胞密度(每毫升105个细胞)和pH值的时间过程
对原始数据进行质量过滤后，我们从每个样本中获得了超过44.5 M的转录本数据。大约84%的转录本读取在参考数据库中找到匹配项。平均而言，在对照CO2组和高CO2组中分别产生38.5%和46.5%的独特映射读数（表S1）。在转录组分析中，共获得66873个单基因，其中上调基因25441个，下调基因6948个。同时，基于iTRAQ的定量蛋白质组学得到32965个多肽和7055个蛋白，其中上调蛋白1246个，下调蛋白580个，共有6831个基因转录本与其对应的蛋白相关。其中，1107个差异表达蛋白（DEPs）（上调：938；下调：169）在正常和高CO2条件下表现出相同的差异表达趋势（表1，图2）。图2 正常和高CO2处理之间基因差异转录和翻译表达的相关性
差异表达基因（DEGs）和DEPs分别为13739个和1326个，分别占总检测基因的20.6%和总检测蛋白的18.8%。通过GO功能富集分析定义和描述差异基因（DEGs），25个显著富集的GO术语（Q值<0.05）在我们的RNA-seq数据中被确定。例如，钙离子结合、钾离子转运、金属离子结合、MAP激酶活性、Arp2/3蛋白复合物和磷氧裂解酶活性在mRNA水平上受到强烈调节（图3A）。根据我们的iTRAQ数据，鉴定出207个富集GO术语（P值<0.05），表明CO2升高组表现出核糖体富集、翻译、细胞氮化合物的代谢过程、蛋白质的代谢过程、基因表达、核酸结合等现象（图3B，表S2）。有趣的是，在我们的RNA-seq和iTRAQ数据中只发现了三个显著富集的GO项，包括细胞内、运动纤毛和MAP激酶活性（图3A、B和表S2）。 图3 蛋白质组分析中（A）和转录组分析中（B）排名前30位的GO术语
A）在转录组中发现的排名前30位的GO术语，红色字体表示显著丰富的GO术语（Q值<0.05），颜色强度表示Q值。B）蛋白质组中排名前30位的GO术语，红色字体表示显著丰富的GO术语（P值<0.05），颜色强度表示P值。为了确定两个CO2处理组中DEGs/DEPs的整体功能分布，我们对数据进行KEGG Orthology（KO）鉴定，共鉴定出9057个DEGs和788个DEPs。我们还通过KEGG途径对DEGs和DEPs进行了功能富集分析，发现只有“RNA transport”在RNA-seq和iTRAQ数据中均富集。此外，13条途径（Q值<0.05）也被注释的DEGs富集，包括蛋白酶体、核苷酸切除修复、鞘脂代谢、色氨酸代谢、半乳糖代谢、碳代谢等（图4）。在我们的iTRAQ数据中，共有11条显著富集的KEGG通路（P值<0.05），这些途径包括核糖体、柠檬酸循环（TCA循环）、氨酰tRNA生物合成、氧化磷酸化、吞噬体、N-聚糖生物合成和脂肪酸代谢等（图4）。 图4 在转录组（Q值<0.05）或蛋白质组学分析（P值<0.05）中，KEGG显著富集的途径
圆圈颜色强度表示Q值或P值，而圆圈大小的富集程度；左边进程名称的字体颜色表示转录、翻译或富集显著的两个级别。我们共鉴定出48个氮代谢相关基因，其中30个表达差异。除少数与氨基酸转运、尿素循环（OUC）和谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶（GS-GOGAT）有关的基因在pCO2升高时下调外，大多数DEG均上调，包括与N转运和同化有关的基因（图5，表3S）。从我们的蛋白质组学数据来看，36个蛋白与氮代谢相关，其中11个表现出强烈的调节作用。除一个AMT外，其余10个DEPs在pCO2升高时均上调，它们在N转运、OUC和GS-GOGAT中发挥作用（图5，表3S）。图5 玛氏骨条藻的氮代谢途径编码基因的转录和蛋白质水平
右边的热图显示了氮代谢相关基因/蛋白质表达水平的变化。颜色强度代表z-分数列上的同质化基因/蛋白质表达值（log2 fold change），从蓝色（最低）增加到红色（最高）。T、转录物；P，蛋白质；NRT，硝酸盐转运体；AAPT，氨基酸/多胺转运体；AAT，氨基酸转运体；AMT，铵转运体；UT，尿素转运体；NR，硝酸还原酶；NiR，亚硝酸盐还原酶（铁氧还蛋白）；CK，氨基甲酸激酶；CPS，氨甲酰磷酸合酶；CPA2，氨甲酰磷酸合酶大亚基；CPA1，氨甲酰磷酸合成酶小亚基；AGM，胍丁胺酶；ARG，精氨酸酶；ASUS，精氨琥珀酸合成酶；ASL，精氨琥珀酸裂解酶；UAP，脲酶辅助蛋白；URE，脲酶；OCD，鸟氨酸环脱氨酶；ODC，鸟氨酸脱羧酶；GS，谷氨酰胺合成酶；GLTD，谷氨酸合成酶（铁氧还蛋白）；GLTB，谷氨酸合成酶（NADPH/NADH）；GDHB，谷氨酸脱氢酶（NAD（P）+963）；GDHA，谷氨酸脱氢酶（NADP+964）；GS-GOGAT，谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶；NA，不可用。除了N相关的转运基因外，我们还从转录组数据中鉴定了其他65个转运相关基因，其中47个差异表达，包括27个上调和20个下调（图6，表3S）。例如，两个无机磷转运蛋白（PiT）、钙激活的K+通道辅助α亚单位（KV，Ca）、金属转运蛋白CNMM（CNMM）、钾通道（K通道）和ABC转运蛋白F家族在CO2浓度升高的条件下上调。与此相反，一个PiT、铜转运蛋白（COT）、硫酸盐通透性（SUP）、硫酸盐转运蛋白（SUT）、锌转运蛋白（ZiT）和ABC转运蛋白A/C/D/G家族在CO2浓度升高的条件下表达下调。在我们的蛋白质组数据集中，我们检测到36种与营养物质运输相关的蛋白（除了氮），其中6种上调，2种下调（图6，表3S）。KV，Ca、PiT、CNMM、K通道和ABC转运体B/F家族蛋白的丰度在CO2浓度升高时显著增加，而ABC转运体A/G家族蛋白的丰度在CO2浓度升高时显著降低。 图6 热图显示了与营养物质运输、钙信号、活性氧稳态、细胞死亡、光合作用和碳固定有关的基因/蛋白质表达水平的变化
颜色刻度代表归一化的基因/蛋白质表达值(log2fold change)在z分数列上，从蓝色（最低）增加到红色（最高）。NA，不可用。在寻找参与光合作用的DEGs/DEPs时，我们发现19个采光复合物II叶绿素a/b结合（Lhca）基因（2个上调，17个下调）和3个Lhca蛋白（下调）在高CO2条件下表现出较强的调控作用（图6，表S4）。在我们的RNA序列数据中鉴定的所有光系统II反应中心（PSII RC）基因（PsbA、PsbB、PsbC、PsbE）均上调，但这并未反映在我们的iTRAQ数据中（图6，表S4）。然而，转录组和蛋白质组数据均表明，在高CO2条件下，析氧络合物下调（图6，表S4）。这将提示未组装的PSII修复循环中间产物的积累，因为如果没有析氧络合物，就不可能组装完整的PSII。作为光系统I（PSI）复合体的核心，PsaA基因的转录水平上调，但在蛋白质组数据集中并非如此（图3，表S4）。在寻找与光合作用电子传递相关的DEG时，我们观察到PSI-RC、PSII-RC和ATP合成酶（叶绿体）的表达显著增加，细胞色素b6-f复合铁硫亚基（petC）、细胞色素c6（Cytc6）、铁氧还蛋白（Fd）和铁氧还蛋白NADP+还原酶（FNR）的表达降低（图6，表S4）。所有参与光合作用电子传递的DEPs都显示出显著的下调，包括Fd、Cytc6和ATP合成酶（叶绿体）蛋白（图6，表S4）。此外，我们还发现了与C3和C4光合作用相关的基因/蛋白，其中一些具有统计学意义。值得注意的是，编码核酮糖1,5-二磷酸羧化酶大链（RBCL）、碳酸酐酶（CA）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶1（PEPC1）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）的蛋白均表现出弱下调（不显著）（图6，表S4）。在我们的RNA-seq和蛋白质组数据集中，许多与线粒体电子传递链有关的基因/蛋白质上调（图7A，表S5），表明在高CO2条件下线粒体中的电子传递增强。值得注意的是，复合物V（ATP合酶）通过氧化磷酸化（OXPHOS）将电子转移回基质以产生ATP。我们观察到OA促进与OXPHOS相关的ATP合成酶的调节，包括H+转运ATP酶、F型H+转运ATP酶、V型H+转运ATP酶（图7A，表S5）。这些结果表明，在高CO2条件下，线粒体ATP的合成被促进。RNA-seq分析表明，15个编码RNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ）的基因、10个与PolⅡ相关的基因和17个与PolⅢ相关的基因在CO2浓度升高的条件下差异表达。除一个RPABC5基因外，所有DEG在CO2浓度升高条件下均显著上调（图7B，表S6）。这种上调趋势反映在蛋白质组数据集中，特别是RPB1、RPB3、RPAC1和RPAC2蛋白质（图7B，表S6）。以上结果表明，CO2浓度升高时，RNA合成增强。在这项研究中，31个与RNA降解相关的基因[例如5'-3'核糖核酸酶、多聚（A）特异性核糖核酸酶mRNA-decapping酶、mRNA-decapping酶1B]在高CO2条件下表达明显改变。其中大多数上调，表明细胞RNA降解上调（图7B，表S6）。差异表达分析表明7个DEPs参与RNA降解。其中，3个DEPs上调，而其他4个DEPs在升高的CO2条件下下调（图7B，表S6）。在蛋白质合成机制中，我们鉴定了62个与真核生物翻译起始因子（eIFs）相关的基因。其中，发现43个eIFs基因在高CO2条件下显著改变表达，并且所有这些DEG均上调（图7B，表S6）。此外，我们的iTRAQ数据揭示了一组23个与EIF相关的DEPs，其中20个显著上调，例如翻译起始因子1（eIF1）和两个翻译起始因子4A（eIF4A）（图7B，表S6）。此外，从转录组数据集中，我们发现51个DEGs（44个上调，7个下调）与内质网（ER）中的蛋白质加工有关（图7B，表S6）。从我们的蛋白质组数据集中，我们发现23种ER相关蛋白在高CO2条件下受到调节，并且所有这些DEPs都上调（图7B，表S6）。这些结果表明，CO2浓度升高可能促进蛋白质的合成和加工机制。此外，我们发现79个基因参与内质网相关蛋白降解，其中37个基因上调，而13个基因在高CO2条件下下调（图7B，表S6）。同时，我们的蛋白质组学分析显示53个蛋白质与内质网相关蛋白降解有关。其中，3种HSP20蛋白在高CO2条件下下调，而其他9种蛋白上调，如HSPA、DnaJ同源亚家族A成员2（DNAJA2）、S相激酶相关蛋白1等（图7B，表S6）。（A）与氧化磷酸化有关的差异表达基因/蛋白质（DEGs/DEPs）综述。（B）DEGs/DEPs参与DNA定向RNA聚合酶I、II和III、RNA降解、真核翻译起始因子、内质网蛋白质加工和内质网相关降解。我们发现38个糖酵解相关基因，其中22个基因（15个上调，7个下调）在高CO2条件下表现出差异表达。有趣的是，编码糖酵解途径限速酶（如己糖激酶（HK）和丙酮酸激酶（PK））的基因在高CO2条件下培养时显著上调（图8，表S7）。这一结果表明，HK和PK的转录上调可能促进糖酵解。同时，我们的蛋白质组学分析鉴定了30种糖酵解相关蛋白，其中8种蛋白的表达发生了显著变化，但在高CO2条件下，HK和PK蛋白没有表现出差异表达（图8，表S7）。因此，从蛋白质组学水平，我们得出结论，糖酵解途径在高CO2条件下没有明显变化。此外，我们还鉴定了65个TCA循环相关基因。其中36个基因，如柠檬酸合成酶（CS）和苹果酸脱氢酶（MDH），在CO2浓度升高的条件下上调，而11个基因，如丙酮酸脱氢酶E1组分α亚基（PDHA）、二氢硫辛酸脱氢酶（DLD）、二氢硫辛酸乙酰转移酶（DLAT）等下调（图8，表S7），说明在CO2浓度升高的条件下，TCA循环增强。在我们的蛋白质组数据库中也发现了类似的结果，即TCA循环加快。表达谱显示，参与TCA循环的24种蛋白质（共47种蛋白质）在海洋酸化的反应中表现出上调，但3种蛋白质表现出相反的表达模式（表S7）。此外，我们搜索了与戊糖磷酸途径有关的基因，发现9个基因（4个上调，5个下调）的转录表达在高CO2条件下发生了显著变化（图8，表S7）。同时，iTRAQ分析表明，在高CO2条件下，注释为6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（PGD）、转酮酶（TKT）和转醛醇酶（TALA）的3种蛋白质显示出显著差异表达（图8，表S7）。葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶（G6PDH）一直被认为是磷酸戊糖途径的限速酶。在这项研究中，我们检测到G6PDH基因在转录水平上下调，但在高CO2条件下，在蛋白质水平上未检测到任何变化（图8，表S7）。综上所述，我们的数据集表明，在二氧化碳浓度升高的情况下，磷酸戊糖途径没有上调，可能略有下调。真核微藻脂肪酸代谢主要包括叶绿体脂肪酸的从头合成、线粒体或内质网脂肪酸的伸长、叶绿体或内质网不饱和脂肪酸的生物合成和线粒体脂肪酸的氧化。在这项研究中，7个与脂肪酸从头合成相关的基因在高二氧化碳条件下表现出显著的高表达。其中5个编码乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）、丙二酰辅酶A-[酰基载体蛋白]转酰基酶（MCAT）、3-氧代酰基-[酰基载体蛋白]合成酶III（KASIII）、3-氧代酰基-[酰基载体蛋白]还原酶（KAR）的基因在高CO2条件下表达下调，而编码3-氧酰基-[酰基载体蛋白]合成酶II（KASII）的2个基因上调（图8，表S7）。蛋白质组学分析表明，在对照组和实验组之间，编码MCAT、烯醇基-[酰基载体蛋白]还原酶I（EARI）和KASII的3个蛋白存在差异表达。其中，MCAT和EARI蛋白在高CO2条件下表现出下调表达谱，而KASII蛋白表现出相反的表达模式（图8，表S7）。我们还对参与不饱和脂肪酸生物合成的基因进行了研究，发现硬脂酰辅酶a去饱和酶（SCD）和omega-6脂肪酸去饱和酶（FAD2）在高CO2条件下表现出强烈的上调。然而，在我们的蛋白质组数据库中，我们仅检测到酰基-[酰基载体蛋白]去饱和酶（ADD）蛋白，其在高CO2条件下没有显示出显著的差异表达（图8，表S7）。对于脂肪酸延伸，我们从转录组中发现了30个相关基因，其中19个基因表达上调，而3个基因表达下调（图8，表S7）。在蛋白质水平上，17个相关蛋白中有6个在高二氧化碳条件下被强烈上调，例如长链酰基辅酶A合成酶（ACSL）（图8，表S7）。对于脂肪酸氧化，我们获得了16个相关基因，其中，9个基因在高CO2条件下上调，而其他4个基因下调（图8，表S7）。从我们的蛋白质组学数据库中，我们共鉴定出13个脂肪酸氧化相关蛋白。在这些蛋白中，6个蛋白在高CO2条件下表现出显著的上调，而2个被注释为ACAT和乙酰辅酶A酰基转移酶1（ACAA1）的蛋白表现出相反的表达模式（图8，表S7）。N-糖基化是真核生物蛋白质合成中的一种主要的共翻译和翻译后修饰。N-聚糖加工发生在分泌途径中，对于糖蛋白被分泌或整合到膜中是必需的。本研究中，我们鉴定了42个与N-聚糖生物合成相关的基因，其中32个基因（28个上调；4个下调）在升高的CO2条件下表现出显著的调控，如多利醇磷酸甘露糖基转移酶（DPM）、多利醇激酶（DOLK）等（图8，表S7）。iTRAQ分析表明，对照组和实验组之间有8种（共15种）参与N-聚糖生物合成的蛋白表达存在差异。值得注意的是，所有这些DEP在CO2浓度升高的条件下都表现出上调（表S7）。这些分析表明，无论是在转录水平还是在翻译水平上，N-聚糖的生物合成在CO2浓度升高的条件下都得到了增强。 图8 热图显示参与糖酵解、磷酸戊糖途径、TCA循环、脂肪酸代谢和N-聚糖生物合成的基因/蛋白质表达水平的变化
颜色刻度代表归一化的基因/蛋白质表达值(log2fold change)在z分数列上，从蓝色（最低）增加到红色（最高）。NA，不可用。活性氧（ROS）是一种典型的副产物，主要是由于NADPH氧化酶（一种呼吸爆发氧化酶）的激活，催化NADPH依赖性的O2还原为细胞内的超氧阴离子（O2·-）。我们搜索了ROS稳态基因，发现在高CO2条件下有26个基因受到显著调控，其中，18个基因在高二氧化碳条件下上调，而8个基因在高二氧化碳条件下下调（图6，表S8）。此外，我们确定了15个与活性氧稳态相关的DEPs，并且所有这些都在CO2浓度升高的条件下表现出上调（图6，表S8）；此外，我们还发现了20个与钙信号相关的基因和4个与钙信号相关的蛋白。除钙通道外，这些DEG大多上调（图6，表8）。同时，2种被注释为钙转运ATP酶和钙转运P型ATP酶的蛋白质在高CO2条件下被发现上调（图6，表S8）。程序性细胞死亡（Programmed celldeath，PCD）是一种由caspase样蛋白表达介导的细胞自催化死亡，常导致细胞凋亡。比较基因组和EST分析已经鉴定了两个不同的caspase样蛋白家族：paracaspase（PCA）和metacaspase（MCA）。迄今为止，将PCD与caspase样蛋白联系起来的实验表明，在某些海洋硅藻中，只有MCAs对应于自溶。在这项研究中，我们发现3个编码MCA的基因在高CO2条件下显著下调，但所有鉴定的MCA蛋白在高CO2条件下的表达水平没有变化（图6，表S8）。目前，大气中二氧化碳含量超过410 ppm，比工业化前高出近50%。这种快速增长的速度在过去5500万年的地质记录中是史无前例的。约25%的二氧化碳被海洋吸收，与海水发生反应，形成弱酸性环境，导致表层海洋pH值每年下降约0.004个单位。这种变化的速度令人担心，因为许多海洋生物可能无法迅速进化以适应这些变化。有一些研究考察了硅藻群落对气候变化变量的短期和长期反应之间的差异。Tatters等人发现，由硅藻克隆分离物组成的“人工”群落在pCO2升高的条件下处理一年，产生了与天然海洋硅藻群落短期（2周）实验中观察到同样的竞争反应。在另一项淡水硅藻群落的长期实验中，在二氧化碳分压升高后超过750代，没有证据表明进化发生了变化。同样地，100代高pCO2的选择在硅藻海链藻中几乎没有适应性或分支选择。这些结果表明，在自然硅藻群落中，长期暴露后对高浓度二氧化碳的进化适应可能是保守的，没有实质性的进化变化。在pCO2升高的情况下，虽然在硅藻物种玛氏骨条藻和三角褐指藻的长期培养过程中观察到了一些小的表型变化，但由于没有检测到进化反应，我们无法确定它是可塑性反应还是适应性反应。因此，研究pCO2升高对硅藻的短期和长期影响及其进化响应具有重要意义。在这项研究中，32389个单基因和1826个蛋白质在高二氧化碳条件下受到显著调控，分别占总基因的48.5%和总蛋白质的25.9%（表1）。本研究发现，在CO2浓度升高的条件下，海洋链球菌生长速度减慢，基因和蛋白质表达发生显著变化，这表明pCO2浓度升高影响海洋链球菌细胞的生理生化特性。因此，接近本世纪末预期条件的海水无机碳系统可能会对海百合的生长产生负面和显著的影响。早期的一项针对单藻污染硅藻的研究发现，变暖（由本世纪末大气pCO2增加引起）和酸化协同作用显著抑制了其生长。与此相反，另一项利用模式硅藻海链藻的调查发现，在亚饱和生长光下，pCO2升高对其生长有积极影响。与我们研究的物种同源的肋骨条藻，在浓度为750 μatm的pCO2富集下生长增强，而在800 μatm时则没有。这些相互矛盾的结果清楚地表明，所有物种对二氧化碳浓度升高的反应并不相同，这对影响浮游植物群落结构以及整个海洋生态系统的生物地球化学循环具有重要意义。通过详细的转录组学和蛋白质组学分析，我们发现高浓度的二氧化碳对海洋链球菌有广泛的代谢影响，但总体结果表明，高浓度的pCO2和随之而来的pH值降低对生长和各种生理过程造成了负向影响。与先前的研究结果一致，我们的研究表明转录组分析比iTRAQ定量蛋白质组学分析产生更多的数据。此外，基因调控可能发生在转录或翻译或翻译后水平，因此转录组学图谱可能无法跟踪蛋白质组学图谱。在本研究中，检测到的大多数蛋白质（60.8%，共6831个蛋白质）与转录物相关（表1，图2），而其他近40%的蛋白质不相关，更多的转录物没有蛋白质支持。因此，转录组数据提供了对细胞代谢更全面的洞察，而蛋白质组数据的连贯部分提供了验证。结合蛋白质组学和转录组学数据集可以让我们在许多情况下对细胞生理学和数据的鲁棒性有一个全面的了解。三种RNA聚合酶（Pol）复合物PolⅠ、PolⅡ和PolⅢ转录遗传信息。PolⅠ、PolⅡ和PolⅢ分别是合成核糖体RNA（rRNAs，~75%）、信使RNA（mRNAs，5-10%）和短结构RNA（主要是5S核糖体RNA（5S rRNA）和转移RNA（tRNAs，~15%）所必需的。在S. marinoi中，我们的转录组和蛋白质组都表明，Pol I、II和III转录物或蛋白质丰度在升高的CO2条件下增加（图9），表明RNA合成被促进。有趣的是，增加的RNA合成似乎被RNA降解途径中基因降解能力的上调所抵消。这可能是由于在高二氧化碳条件下需要加速细胞代谢途径的重组。“组学”数据集揭示的不同代谢途径的显著动力学支持了这种可能性。图9 玛氏骨条藻在高二氧化碳条件下基本生物途径的示意图
RBCL，核酮糖二磷酸羧化酶大链；PSII，光系统Ⅱ反应中心；PSI，光系统Ⅰ反应中心；OEC，析氧复合物；Lhca，捕光复合物Ⅰ叶绿素a/b结合蛋白；Cytb，细胞色素b6-f复合物；Fd，铁氧还蛋白；FNR，铁氧还蛋白NADP+988还原酶；ACL，ATP柠檬酸（pro-S）-裂解酶；CS，柠檬酸合成酶；PK，丙酮酸激酶；PDHA，丙酮酸脱氢酶E1组分α亚单位；PDHB，丙酮酸脱氢酶E1组分β亚单位；I，NADH脱氢酶；II，琥珀酸脱氢酶；III，细胞色素c还原酶；IV，细胞色素c氧化酶；ATPs，ATP合成酶；Pol I，RNA聚合酶I；Pol II，RNA聚合酶II；Pol III，RNA聚合酶III；eIFs，真核翻译起始因子；PABPC，聚腺苷酸结合蛋白；TRAPα，易位相关蛋白亚单位α；TRAPβ，易位相关蛋白亚单位β；Sec61，蛋白转运蛋白Sec61；Sec62，易位蛋白Sec62；Sec63，易位蛋白Sec63。OA强烈影响的代谢途径之一是蛋白质合成。在真核细胞中，蛋白质合成的起始可分为三个步骤：首先，用甲硫酰基转移RNA诱发剂（Met-tRNAi）组装40S核糖体亚基；其次，将合成的大分子复合物与mRNA的起始密码子结合；第三，60S核糖体亚基参与生成有翻译能力的核糖体。以前的文献已经证明，所有这三个步骤都是由真核生物翻译起始因子（eIFs）促进的。我们的数据显示，在升高的CO2条件下，与海洋链球菌eIF相关的大多数基因或蛋白质上调（图7B），表明翻译起始活性增加，因此蛋白质合成增加。真核细胞中大多数mRNAs的翻译起始是由核糖体完成的。在此之后，新合成的多肽被运输或整合到内质网（ER）膜上进行蛋白质折叠、分泌、糖基化，并促进ER腔中错误折叠蛋白质的降解。有证据表明，Sec61/SecY复合物在多肽链穿过内质网膜的过程中围绕着多肽链，是蛋白质易位的必要元素。我们的转录组学和蛋白质组学数据均显示，在高二氧化碳条件下，SEC61复合物上调（图9）。此外，在RNA-seq和iTRAQ分析中，我们发现在高CO2条件下，内质网（ER）中的蛋白质加工也被强烈加速（图9）。在真核生物中，超过50%的蛋白质是糖蛋白。发生在内质网中的N-聚糖生物合成与糖蛋白的折叠和保留、稳定性和转换、细胞内运输、识别和降解以及生理功能密切相关。此外，N-聚糖还可以作为识别标签，允许糖蛋白与糖基转移酶、糖苷酶和凝集素相互作用。有趣的是，在pCO2升高的情况下，转录组学和蛋白质组学分析均表明N-聚糖生物合成上调，表明N-聚糖形成升高（图9），这可能促进糖蛋白的修饰。总之，这些结果表明，升高的二氧化碳诱导了蛋白质合成和加工的增加。内质网相关降解（ERAD）途径是通过识别和降解正常和错误折叠的蛋白质来维持蛋白质稳定的关键。我们的结果表明，ERAD的分子机制在高CO2条件下被激活。这与我们的假设一致，即需要加速代谢重构，此外还需要维持细胞内的蛋白质稳定。在二氧化碳浓度升高的情况下，蛋白质可能会发生更多的错误折叠或组装，这就需要在ERAD系统中降解这些错误折叠的蛋白质，同时合成新的蛋白质。蛋白质合成和降解的增加，虽然可能是细胞应对二氧化碳升高的一个有用策略，但会将细胞资源从其他细胞功能（如增殖）转移。在大肠杆菌中，研究表明，蛋白质产量增加导致细胞生长减少和细胞周期停滞。这种资源的重新分配，或压力应对和扩散之间的权衡，似乎发生在玛氏骨条藻。经过10代适应后，Thangaraj和Sun发现OA确实引起了蛋白质加工机械的活化，这是由于骨骼肌中氨基酸合成和氮同化的增加。这一结果与我们的研究一致，因此我们推测激活蛋白加工机制可能是骨骼肌对OA的一种适应。在CO2浓度升高的条件下，海鳗的种群增长率下降，蛋白质生产能力增强。其他硅藻是否也存在类似的调控机制值得进一步研究。光合碳固定依赖于核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco），这种酶催化光合CO2同化的第一步和关键步骤。由于Rubisco的效率非常低，天然海水中的CO2浓度（~10-15 μM）不足（半饱和浓度>25 μM）。通常，硅藻和许多其它种类的浮游植物利用碳富集机制（CCM）克服环境细胞的上坡梯度来获取碳。这包括C4光合作用、碳酸酐酶（CA）和碳酸氢盐转运蛋白。C4途径已被证明存在于硅藻中并在硅藻中起作用。由于CCM需要能源，OA能否降低CCM的容量从而节约能源一直是一个争论的话题。在这项研究中，我们发现海洋链球菌确实具有C4途径，并且在高CO2条件下它确实被下调。C4途径涉及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC），它将碳酸氢盐固定到细胞质中的草酰乙酸（OAA，C4酸）中，然后运输到叶绿体。一般来说，硅藻有两种PEPC蛋白，由于亚细胞定位的不同，这两种蛋白可能具有不同的功能。与先前的研究一致，我们的研究揭示了在海洋链球菌中存在两个编码PEPC的基因（命名为PEPC1和PEPC2）。CELLO分析预测PEPC1蛋白存在于细胞质中，而PEPC2蛋白存在于线粒体中。因此，可能是PEPC1，而不是PEPC2，在与光合作用固碳相关的C4途径中起作用。CCM的衰退也表现在CA蛋白表达的降低上。然而，如果CCM机制降低节省了能量，它就不会再投资于光合作用，因为Rubisco的大亚基（RBCL）也表现出微弱的下调（尽管不显著）（图9）。结合蛋白质组学和转录组学数据，我们发现CCMs可能受到pCO2升高的弱下调，RBCL的弱下调表明碳固定能力略有下降。与上述评估一致，蛋白质组学和转录组学分析表明，在pCO2升高的情况下，放氧复合物（OEC）、采光复合物I叶绿素a/b结合蛋白（Lhca）、细胞色素c6（Cytc6）和铁氧还蛋白（Fd）表达下调（图9），表明线性电子流（LEF）和循环电子流（CEF）减少，导致ATP合成减少。因此，pCO2升高引起叶绿体ATP合酶的下调。通过糖酵解、三羧酸（TCA）循环、戊糖磷酸途径（PPP）、线粒体电子传递和氧化磷酸化产生ATP、NAD（P）H和各种中间碳化合物的能量代谢是细胞维持和生长所必需的。海水酸度的增加和pCO2的升高会干扰细胞内pH值的稳定性，因此硅藻可能需要更多的能量来维持细胞内稳态。先前的一篇关于硅藻和球虫的报道表明，pCO2升高可增加糖酵解、TCA循环和脂肪酸途径的β-氧化活性。对0.4%CO2培养的亚椭圆球虫C-169的转录组学分析表明，在pCO2增加的情况下，主要是TCA循环、糖酵解和氧化磷酸化上调，这种模式可以提供更多的能量和中间碳化合物来应对环境胁迫。在这项研究中，大多数在线粒体呼吸中发现的DEGs或DEPs在升高的CO2条件下上调，表明能量代谢能力增强。脂质的合成和消耗也是重要的能量途径。CO2变化对骨骼藻脂肪酸含量和组成的影响已有报道，但在不同物种间似乎存在差异。例如，在骨骼藻中，总脂肪酸浓度在pCO2升高的情况下显著降低。相反，高温和pCO2（25℃，1000 ppm）提高了杜氏酵母菌的脂肪酸产量。在我们的iTRAQ研究中，我们发现在二氧化碳浓度升高的条件下脂肪酸代谢显著增加（图4）。在最初的脂肪酸生物合成中发现的大多数DEG/DEPs在CO2升高时下调，表明脂肪酸合成能力降低（图8、9）。然而，在我们的研究中，高二氧化碳似乎促进了长链脂肪酸（LCFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）的合成。KASII通过从头脂肪酸生物合成途径中两个碳单元的缩合，介导C16:0-ACP向C18:0-ACP的延伸。随后，C18酰基可作为长链脂肪酸（LCFA）延伸的前体。有趣的是，KASII转录物和蛋白质都上调，与LCFAs合成相关的基因/蛋白质也上调，如ACSL、ELOVL5、VLKAR和VLECR（图8），它们可能促进LCFA的产生。此外，从转录组学上，我们发现编码硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）和ω-6脂肪酸去饱和酶（FAD2）的2个基因表达上调，如果在蛋白质和活性水平上被证实，这表明多不饱和脂肪酸（PUFA）的产生被促进。与本研究中的发现一致，Liang等人证明，增加pCO2有利于杜氏盐藻中多不饱和脂肪酸的合成。为了有效利用贮藏油脂，脂肪酸需要通过脂肪酸β-氧化作用从酰基辅酶a完全转化为乙酰辅酶a。有趣的是，许多与β-氧化相关的基因/蛋白质被上调，这可能为海洋链球菌细胞的生存和生长产生更多的能量。如前所述，β-氧化是活性氧形成的一个潜在场所，因为β-氧化的中间产物和副产物会干扰抗氧化机制。因此，我们推测β-氧化与配合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ一样，也能促进ROS的产生。总之，酸化条件下总脂肪酸的减少和LCFA、PUFA和β-氧化的增加可能影响细胞的生长和存活、膜脂的周转和贮藏脂的快速动员。在我们的研究中，硝酸盐是海洋链球菌唯一的氮源。从转录组数据集，我们发现硝酸盐转运体（NRT）、硝酸还原酶（NR）和亚硝酸盐还原酶铁氧还蛋白（NiR）在升高的CO2条件下均上调，但蛋白质水平没有显著变化（图5，表3S），增加了氮吸收增加的不确定性。然而，氨甲酰磷酸合成酶（CPS）和谷氨酰胺合成酶（GS）在高CO2浓度下在转录和翻译水平均上调（图5，表3S），表明氮同化和尿素循环加速。有趣的是，在pCO2升高的情况下，无机磷转运蛋白也上调。这与前面讨论的能量代谢的强化是一致的，这可能需要更多的磷。我们还发现ABC转运蛋白家族表现出明显的调节作用。ABC转运蛋白结合ATP并利用能量使多种分子穿梭于不同的细胞膜上。金属是微藻细胞发挥其细胞功能所必需的，因为它们不仅是光合系统的组成部分和维生素的组成部分，而且还是参与二氧化碳固定、硝酸盐还原、磷获取和DNA转录的酶的辅助因子。结合我们的转录组学和蛋白质组学数据，我们发现在高二氧化碳条件下，金属的摄取，如钙、钾、锌和铁，表现出明显的上调。这表明海洋链球菌可能需要更多的金属离子来应对pH值的降低；或者，摄取基因的上调可能表明在酸化条件下金属的生物利用度降低，如铁的情况所示。在植物中，ROS-钙信号被认为是重要的信号介质，参与许多细胞过程，包括生长、发育、分化、程序性细胞死亡（PCD）等。在这项研究中，我们特别关注ROS、钙信号和PCD之间的交叉关系。大量的文献表明，Ca2+或钙调素（CaM）引起NADPH氧化酶的激活，从而增加ROS的产生。以往的研究表明，硅藻利用一种新的、高度敏感的钙依赖性信号通路来感知和响应非生物环境信号。例如，aeqourin转化的三角褐指藻细胞对机械刺激表现出快速的胞浆Ca2+升高。经过一段时间的磷（P）有限的增长，磷的再补给导致三角褐指藻Ca2+快速、短暂地升高。在玛氏骨条藻的转录组学研究中，我们发现钙转运P型ATP酶和Ca2+通透性通道在升高的CO2条件下均上调（图6，表S8），这可能促进Ca2+快速流入胞浆。有趣的是，一些钙离子外流基因，如双孔钙通道蛋白1和钙转运ATPase，在高CO2条件下也表现出上调。Ca2+通量的潜在增加可能预示着在高CO2条件下钙信号的加速。先前的研究也表明OA可以影响微藻的环境感知，从而提高细胞内Ca2+通量。因此，我们推测激活的钙转运和钙信号可能是对pCO2升高的反应。ROS能与蛋白质、核酸和脂质迅速反应，从而导致严重的细胞损伤和细胞死亡。由谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等多种酶促抗氧化剂和抗坏血酸等小分子非酶促抗氧化剂组成的ROS清除系统可以清除潜在的毒性自由基。也就是说，清除机制使细胞内ROS的稳态水平受到严格控制。RNA-seq分析提示NADPH氧化酶的上调触发了ROS产生的增加。相应地，在pCO2升高的情况下，大多数DEGs和所有被注释为酶促抗氧化剂的DEPs均上调，表明活性氧清除能力增强。有人提出，程序性细胞死亡（PCD）可以触发更高剂量的活性氧。在海洋硅藻中，元糖酶（MCA）被认为是PCD最常见的分子标记。然而，虽然MCA基因在CO2浓度升高的条件下表现出明显的下调，但MCA蛋白的表达没有明显变化。尽管存在差异，转录组学和蛋白质组学数据都一致认为pCO2升高不会诱发PCD。这可能是因为玛氏骨条藻能够保持稳定的活性氧水平，由于其上调活性氧清除能力。我们的研究表明，高浓度的二氧化碳抑制了玛氏骨条藻的光合作用和生长，而“组学”数据表明，这可能是由于叶绿体中光合作用和脂肪酸生物合成受损以及线粒体能量代谢增强所致。同时，我们的数据揭示了氮代谢、转录活性和翻译活性的上调，这意味着蛋白质合成潜力的提高。在pH值降低的情况下，蛋白质合成和能量代谢的增加可能是维持细胞内稳态所必需的。此外，升高的pCO2似乎促进了玛氏骨条藻中ROS的产生和抗氧化应激能力，并且由于ROS和抗氧化剂的平衡，我们未观察到PCD的诱导。总的来说，升高的pCO2似乎会导致大量的基因表达重组，以增加蛋白质合成、能量代谢和抗氧化应激防御，从而维持pH值的稳态和种群的生存。尽管玛氏骨条藻在长期暴露后对OA的进化适应可能是保守的，但值得注意的是，在短期和长期培养之间观察到了一些表型变化。因此，进一步的研究应集中在玛氏骨条藻对OA的长期生理反应上。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33355106/
本站仅提供存储服务，所有内容均由用户发布，如发现有害或侵权内容，请
点击举报。
