编译：凉风月，编辑：十九、江舜尧。
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导读
不定根对重要经济木本植物的无性繁殖至关重要。深入理解促进或阻碍生根的遗传和生理机制可以提高树木成功商业化应用的潜力。长非编码RNA（lncRNAs）在广泛的生物学过程中发挥着重要的调控作用。近年来大量的lncRNA在植物中被发现，而木本植物中的lncRNA很大程度上仍属未知。本研究的研究者在全基因组水平上系统鉴定和表征了杨树不定根不同发育阶段表达的lncRNA，首次鉴定了与杨树根形成有关的lncRNA，比较了lncRNA和基因在结构和表达上的差异，并探索和验证了两个关键lncRNA：lncWOX5和lncWOX11的功能。
论文ID
原文：Identification and characterization of long non-coding RNAs involved in the formation and development of poplar adventitious roots
译名：杨树不定根形成和发育中涉及的长非编码RNA的鉴定和表征
期刊：Industrial Crops & Products
IF：4.191
发表时间：2018年8月
通讯作者：胥猛
通讯作者单位：南京林业大学南方现代林业协同创新中心，南京林业大学林学院
DOI号：10.1016/j.indcrop.2018.03.071
实验设计
以欧美杨和美洲黑杨为材料，杂交培育品种名“南林895”的杂交杨，在光暗周期为16h/8h，对应温度25℃/18℃的温室内培养，收集不定根切段（CKS），一周龄（WR1），两周龄（WR2）试管苗的不定根样本，每个样本两个生物学重复，每个重复从多个扦插样本中获得。然后对所得样本进行RNA提取、检测和转录组测序和qRT-PCR验证。根据lncRNA结构和非编码功能特点进行筛选，以FPKM为指标量化lncRNA和mRNAs表达水平，以q < 0.05,|log2(FC)| < 1为显著差异表达阈值。接着进行lncRNA靶基因预测，并对所得基因进行GO和KEGG分析，对lncWOX5和lncWOX11进行克隆和测序，最后利用Gateway技术构建了用于杨树的原生质体。
图1 杂交杨中新型lncRNA预测流程图
研究内容
1.杂交杨lncRNA的鉴定与特性研究
通过RNA-Seq从6个cDNA文库中获得578793120个粗读数和71.74G清洁碱基(表1)。根据HTSeq分析，92%以上的阅读片段分布在蛋白质编码基因中，仅一小部分分布在非编码基因中。将256620个组装的转录本用于筛选lncRNA。经过5个步骤的基本筛选，保留了7151个转录本，用于CPC和PfamScan的蛋白质编码潜力分析(图2a)。最后，通过CPC和PfamScan分析，共获得5952个共同的LncRNA(图2b)，它们均匀分布在19条没有明显偏好性的杨树染色体上(图2c)。根据它们在杨树基因组中的位置，鉴定出4481个lincRNAs，761个反义lncRNAs和710个内含子lncRNAs(图2d)。
SamplesRaw readsClean basesError rate (%)Q20 (%)Q30 (%)GCcontent (%)
CKS192,658,65610.99G0.0295.0488.9842.97
CKS295,191,26011.37G0.0295.4189.5843.35
WR1195,356,00411.92G0.0395.7089.1143.74
WR12104,817,91813.01G0.0198.3795.7843.86
WR2197,604,18812.11G0.0198.2395.4744.03
WR2293,902,92611.74G0.0395.5088.7844.05
表1 测序质量
图2 杂交杨lncRNA的筛选和分类。(a) lncRNA的基本筛选图。(b) 按CPC和Pfam筛选结果。(c) lncRNA沿19个杨树染色体的分布。三个同心环分别从外到内对应于CKS，WR1和WR2中lncRNA的表达水平。(d)不同类型的lncRNA的组成。
保守分析(eValue< 1e-10)表明，5952个杨树lncRNAs中只有7个在拟南芥中是保守的。比较它们的结构表明，内含子的lncRNAs比反义的lncRNAs和lincRNAs短得多，外显子也少(图3a和b)。内含子lncRNAs在CKS、WR1和WR2中的表达水平高于反义lncRNAs和lincRNAs(图3 c-e)。
图3 三种lncRNA的结构和表达水平的比较分析。(a)三种lncRNA的转录本长度。(b)外显子数量。三种lncRNA分别在CKS(c)，WR1(d)和WR2(e)中的表达水平。
对lncRNAs和mRNAs的结构分析表明，杂交杨lncRNAs和mRNAs的长度范围分别为200 - 8603和65 -16054 nt，平均长度分别为385和1409 nt(图4a)。LncRNA有1- 6个外显子，其中74.61%只有一个外显子(图4b)。mRNA有1-76个外显子，78.83%的mRNA外显子数目≤7个(图4b)。lncRNA的开放阅读框(ORF)长度为18 – 268 nt，平均55nt，其中96% ≤ 100nt(图4c)。mRNA的ORF长度为21-5317nt，平均为374nt，90%以上大于100nt，长度分布相对均匀(图4c)。进一步比较lncRNAs和mRNAs的表达水平和长度分布可知，lncRNAs的表达水平明显低于mRNAs，且大多数lncRNAs的表达水平较低(图4d)。
图4 lncRNA和mRNA之间的结构和表达水平的比较。(a) 转录长度在lncRNA和mRNA中的分布。(b) lncRNA和mRNA中外显子数目的分布。(c) lncRNA和mRNA中ORF数量的分布。(d) lncRNA和mRNA之间的表达水平的比较。
2.lncRNA的差异表达
研究者分析了三个对照组来确定lncRNAs的差异表达：WR2与CKS，WR1与CKS，以及WR2与WR1。对于WR1和CKS，鉴定出404个差异表达的LncRNAs(DEL)：217个上调，187个下调(图5a)。对于WR2与CKS，鉴定出666个DEL：362个上调，304个下调(图5b)。对于WR2与WR1，鉴定出381个DEL：228个上调，153个下调(图5c)。总共获得了933个DEL，其中61个为三个对照组共有(图5d)。
图5 分析差异表达的lncRNA(DELs)。(a–c)不定根发育过程中差异表达的lncRNA 。红点代表显着上调的基因，绿点代表显着下调的基因。(d)常见和特定DELs的维恩图。
在三个比较中，DEG的数量比DEL多，并且WR2与CKS的DEG和DEL的百分比最高，而WR2与WR1的DEG和DEL的百分比最低（图6,a和b）。此外，三组中从高到低的三种类型DEL的百分比依次为lincRNA，反义lncRNA和内含子lncRNA（图6,c-e）。WR2与CKS的DEL百分比最高，而WR2与WR1的DEL百分比最低（图6,c-e）。为了证实DEL的可靠性, 尽管表达丰度有所不同，但随机选择了15个DEL并通过qRT-PCR检查，结果与RNA-seq数据一致（R2 = 0.91789，P < 0.001）(图7)。
图6 DEG和DEL的比较分析。(a) 三个比较组（WR1对CKS，WR2对CKS和WR2对WR1）中所有基因中DEG的百分比。(b) 三个比较组中所有lncRNA中DEL的百分比。(c–e)三个比较组中所有lncRNA中三种DEL的百分比。
图7 RNA-seq和qRT-PCR表达结果比较
根据基因的时间表达模式，短时间序列表达挖掘(STEM)分析可以对表达模式相似的基因进行聚类。对DELs和DEGs的STEM聚类分析表明，DELs在轮廓1、6和9(图8a)中显著富集(P<0.01)，DEGs在轮廓1、2、6和轮廓9(图8b)中显著富集。轮廓1和2的表达量有逐渐减少的趋势，而轮廓6和9的表达量有逐渐增加的趋势。总体而言，DELs和DEGs表现出相似的表达趋势。
图8 DEL(a)和DEG(b)的短时间序列表达挖掘(STEM)聚类分析。聚类由基于置换测试和其他非重要轮廓而显着丰富的彩色轮廓组成。左上方指示配置文件的ID。左下角指示分配给配置文件的DEL或DEG的数量。黑线代表模型概况，红线代表个别DEL或DEG表达概况。
3.植物生长素信号转导途径中涉及的lncRNA
研究发现，共有34个LncRNA靶基因参与生长素信号转导途径：4个AUX1基因，16个AUX/IAA基因，2个ARF基因，1个CH3基因和11个SAUR基因(图9)。CKS中17个DEGs(3个AUX1，13个AUX/IAA和1个CH3)的表达水平高于WR1和WR2(图9)。相比之下，WR1和WR2中9个DEGs(2个ARF和7个SAUR)的表达水平高于CKS(图9)。对于顺式作用，144个lncRNAs可能调控了34个DEGs，其中21个lncRNAs调控4个AUX1，78个lncRNAs调控16个AUX/IAA，6个lncRNAs调控2个ARF，1个lncRNA调控1个CH3，38个lncRNAs调控11个SAUR基因。有趣的是，5个lncRNA可能同时调控ARF基因和SAUR基因。
图9 杨树lncRNA的潜在靶标DEG 参与生长素信号转导途径。(a)生长素信号转导途径。(b)生长素信号转导途径中涉及的34个lncRNA靶DEG的表达模式。
4.长非编码RNA lncWOX5和lncWOX11的克隆与表达分析
从'南林895’根中克隆到长度分别为298bp和215bp的lncWOX5和lncWOX11。经过100 kb范围内的共定位和表达分析，研究者发现lncWOX5和lncWOX11分别有16个和8个潜在的靶基因(图10)。为了进一步验证潜在目的基因的真实性，将过表达质粒lncWOX5(35S：lncWOX5)和lncWOX11(35S：lncWOX11)转入杨树原生质体。孵育16h后，用qRT-PCR检测lncWOX5、lncWOX11及其潜在靶基因的表达水平(图11)。在过表达lncWOX5和lncWOX11的原生质体中，lncWOX5和lncWOX11的表达水平分别比未转染的原生质体(CK+)高212.8倍和16.6倍(图11A和图11F)。研究者选择了10个受空质粒影响较小的蛋白编码基因，包括lncWOX5(图11b-e)的4个靶基因和lncWOX11(图11g-l)的6个靶基因。其中，在过表达lncWOX5的原生质体中，WOX5和POPTR_0008s06340的表达显著下调，分别下降了35.7倍和25.6倍(图11b和图c)。在过表达lncWOX11的原生质体中，WOX11和POPTR_0013s06300的表达显著上调，分别增加了4913.8倍和83.8倍(图11,g和l)。
图10 lncRNA及其潜在靶基因的相互作用网络。(a) lncRNA lncWOX5及其潜在靶基因的网络。(b) lncRNA lncWOX11及其潜在靶基因的网络。图形“ V”代表lncRNA lncWOX5或lncWOX11，圆圈节点代表lncWOX5或lncWOX11的潜在靶基因。黄色圆圈代表高概率，紫色圆圈代表lncWOX5或lncWOX11的靶基因的概率低。红色箭头表示正调节，红色“ T”线表示负调节。（要解释此图例中对颜色的引用，请参阅本文的网络版本。）
图11 lncRNA及其潜在靶基因之间相互作用的qRT-PCR 分析。(a) LncRNA lncWOX5；(b–e) lncWOX5的潜在靶基因；(f) lncRNA lncWOX11；(gl) lncWOX11的潜在靶基因。CK +，未转染的原生质体；用空载体p2GWF7转染的CK-，原生质体；lncWOX5，用35S：lncWOX5转染的原生质体；lncWOX11，用35S：lncWOX11转染的原生质体。
基因注释显示，POPTR_0008s06560编码WOX5蛋白，POPTR_0008s06340编码ProT2，POPTR_0013s06310编码WOX11，POPTR_0013s06300编码PRX70蛋白（表2）。lncWOX5，lncWOX11 和这四个靶基因的表达水平在不定根发育的不同阶段都有明显变化（图12a和b）。其中，lncWOX5，WOX5和WOX11的表达水平在WR1中最高，而在CKS中最低（图12a和b）；lncWOX11在WR1中表达最高，在WR2中最低（图12b）。
lncRNA IDTarget gene IDTarget gene description
TCONS_00340533 (lncWOX5)POPTR_0008s06560WUSCHEL-related homeobox5 (WOX5)
POPTR_0008s06340Proline transporter 2 (ProT2)
POPTR_0008s06380Phosphate translocator-related family protein
POPTR_0008s06410Adenylosuccinate lyase-like
TCONS_00105184 (lncWOX11)POPTR_0013s06310WUSCHEL-related homeobox11 (WOX11)
POPTR_0013s06240Glycosyltransferase family 14 (GT14)
POPTR_0013s06260C2 domain-containing family protein
POPTR_0013s06270C2 domain-containing family protein
POPTR_0013s06290Cyclic dof factor 3-like (CDF3)
POPTR_0013s06300Class III peroxidase (PRX70)
表2 lncWOX5/lncWOX11的重要靶基因
图12 lncWOX5 / lncWOX11及其潜在靶基因的表达模式分析。(a和b) lncWOX5 / lncWOX11 及其潜在靶基因在不定根发育不同阶段的表达模式。CKS，1周龄的茎；WR1， 1周龄不定根；WR2，两周龄不定根。(c和d) lncWOX5 / lncWOX11及其潜在靶基因在胡杨不同组织中的表达模式。
讨论
1. 杨树lncRNAs和蛋白编码转录本的结构和表达差异
在本研究中，研究者鉴定了5952个lncRNAs：4481个lincRNAs，761个反义lncRNAs和710个内含子lncRNAs。以前对这三种类型的lncRNA进行系统比较的研究很少。本研究结果表明，这三种类型的lncRNAs在转录长度、外显子数量和表达水平方面存在显著差异(图3)。与lincRNAs和反义lncRNAs相比，内含子lncRNAs的转录长度和外显子数目较低，但表达水平较高。有趣的是，内含子差异表达的lncRNAs的百分比远低于其他两种类型的lncRNAs。比较表明，杨树lncRNAs比蛋白质编码转录本更短，外显子更少，表达水平也明显低于蛋白质编码转录本(图4)。这些结果与以前在拟南芥、水稻和毛白杨中的研究结果一致。此外，以前的研究表明，在2542个毛白杨lincRNAs中，只有6个在拟南芥中有同源基因。本研究结果显示，在5952个杨树lncRNA中只有7个在拟南芥中保守。这些结果表明，不同植物之间的lncRNAs保守性较差。在其他一些植物中也发现了类似的结果，包括拟南芥、水稻。
2 . lncRNAs和生长素在根发育中的作用。
以往的研究表明，拟南芥AUX/IAA家族成员大多与侧向生长发育相关，如AtIAA3、AtIAA14、AtIAA19和AtIAA28。植物中ARF家族成员众多，其时空表达模式复杂。AtARF7和AtARF19具有功能冗余：ARF7-arf19双突变体侧根数量显著减少，而ARF7单突变体没有表型变化。AtARF7和AtARF19通过直接调控一些LBD/ASL基因来调控侧根的发育。与Osarf12单一突变体相比，Osarf12 Osarf25双突变体具有明显的根缺失表型。研究者先前发现ARFs参与了杨树不定根的发育。本研究从不同发育阶段的杨树不定根中鉴定了与生长素调控途径有关的34个DEGs。有趣的是，大多数AUX/IAA基因在茎(CKS)中的表达高于在根(WR1和WR2)中的表达，而ARF基因的表达模式则相反(图9)。以往的研究表明，在低生长素条件下，ARF活性受到AUX/IAA的抑制。相反，当生长素含量增加时，AUX/IAA被SCF TIR1/AFB复合物降解，以解除ARF的抑制。因此，推测茎中生长素的含量可能低于根，从而导致AUX/IAA对ARFs的抑制作用。此外，这34个DEGs还受到144个lncRNAs的顺式调控，这为生长素在不定根发育中的调控提供了一个新的视角。
3.lncWOX5/lncWOX11与WOX5/WOX11之间的调节关系
研究者先前在杂交杨树'南林895’中发现了PeWOX11和PeWOX5基因，其中PeWOX11a和PeWOX11b参与了杨树不定根的形成，并且主要在不定根中表达。过表达PeWOX11a和PeWOX11b可以诱导插条上不定根的数量增加，并诱导茎上的异位根。此外，在PeWOX11b过表达的转基因株系中，在萌发的枝叶中也能诱导出大量的异位根。PeWOX5位于细胞核内，主要参与杨树不定根的发育调控。对PPtoWOX5a：GUS转化杨树的GUS染色分析表明，GUS信号主要出现在不定根帽区后面的较小区域。此外，PtoWOX5a可以在功能上补充质量控制中的AtWOX5。过表达PtoWOX5a可以增加不定根的数量，缩短不定根的长度。同时，过表达PtoWOX5a还能促进不定根尖和侧根尖肿胀。综上所述，WOX5和WOX11在草本植物和木本植物不定根的发育过程中起着重要作用。它们在拟南芥中的功能已经得到了广泛的研究，在木本植物中的作用也得到了初步的探索。然而，WOX5和WOX11是否受lncRNAs调控尚未见报道。在本研究中，研究者鉴定了两种分别调控WOX5和WOX11的lncRNAs(lncWOX5和lncWOX11)。过表达lncWOX5使WOX5表达降低35.7倍，过表达lncWOX11导致WOX11表达增加4913.8倍(图11b和图g)。表达模式分析表明，lncWOX5主要在根中表达，而lncWOX11普遍表达(图12C和图d)。
结论
在本研究中，研究者通过高通量测序获得了大量的LncRNA。还确定了最初的特征克隆了两种可能参与不定根发育调控的lncRNAs(lncWOX5和lncWOX11)。两种lncRNA以及它们之间的调控关系需要进一步验证。目前尚不清楚lncWOX5和lncWOX11调控靶基因的途径和分子机制。然而，lncWOX5和lncWOX11的鉴定提高了对“生长素-WOX11-WOX5/LBD16”不定根再生途径的认识。lncRNAs的发现和鉴定为不定根的研究提供了一个新的视角，可以更清楚地了解根的形成和发育。此外，克隆和鉴定促进或阻碍杨树生根的lncRNAs将提高困难地造林成功的可能性。
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