吉林大学第二医院潘薇课题组揭示PKCβ通过上调FTO/PGC-1α/ UCP1信号通路来缓解EN2基因敲除小鼠的自闭症样行为

撰稿丨脑声常谈 左卿（笔名）

排版丨脑声常谈 编辑团队

蛋白激酶Cβ（PKCβ）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与各种细胞生理过程，如氧化应激诱导的细胞凋亡、细胞分裂和分化，以及内皮细胞增殖。过去研究表明，自闭症患者大脑中PKCβ基因的表达显著下调，暗示PKCβ基因在自闭症发病机制中的潜在作用。此外，PKCβ介导的信号通路可以影响质膜多巴胺转运体的定位和功能，该转运体与BPD和ASD等神经精神疾病有关。因此，PKCβ作为ASD患者治疗干预的一个新的潜在靶点，值得进一步研究。

在此背景下，2022年10月14日，吉林大学第二医院儿科潘薇课题组在Journal of Biochemical and Molecular Toxicology (JBMT) 发文，揭示了PKCβ通过上调FTO/PGC-1α/ UCP1信号通路来缓解EN2基因敲除小鼠的自闭症样行为。

首先，课题组对GSE51612数据集的差异分析显示，PKCβ在EN2-/-小鼠中表达较低。三箱社交结果显示EN2-/-小鼠对陌生小鼠的探索时间显著降低；此外，其在旷场中央的穿过次数显著也显著减少；即表现出社交障碍和焦虑样表型。TUNEL染色结果显示：EN2-/-小鼠模型中神经元的凋亡数量增加。RT‐qPCR和WB结果显示：EN2-/-小鼠脑组织和大脑皮层神经元中PKCβ的表达量显著下调。流式细胞术的结果显示：EN2-/-小鼠的神经元凋亡增加。此外，课题组发现PKCβ的过表达缓解了EN2-/-小鼠的自闭症样行为并减少了其凋亡细胞的数量。

图1|EN2-/-小鼠脑组织和大脑皮层神经元中PKCβ的表达量显著下调、凋亡细胞增加

过去研究表明PKCβ可以抑制脂肪和肥胖相关蛋白（FTO）的降解。为了探究PKCβ是否也能抑制神经元中FTO的降解，课题组分别用oe-PKCβ（过表达PKCβ）和sh-PKCβ（低表达PKCβ）处理分离的神经元。RT-qPCR和WB结果显示：oe-PKCβ和sh-PKCβ处理对FTO的mRNA表达无影响；但oe-PKCβ和sh-PKCβ分别上调和下调了FTO的蛋白表达。此外，课题组发现过表达PKCβ抑制了FTO的泛素化水平。免疫共沉淀实验进一步证实了PKCβ与FTO的相互作用。进一步的WB结果显示：在蛋白合成抑制剂CHX的处理下，PKCβ的敲除降低了FTO蛋白的稳定性，而MG132（蛋白酶体抑制剂）的处理增加了细胞中FTO蛋白的水平，表明敲除PKCβ促进了FTO蛋白的蛋白酶体降解。这些结果表明，PKCβ可以抑制FTO的泛素化和降解，从而稳定其在皮质神经元中的表达。

图2| PKCβ抑制FTO的泛素化和降解并稳定其在小鼠大脑皮质神经元中的表达

FTO是一种m6A去甲基化酶，通过去除mRNA上的甲基化修饰来调节mRNA的稳定性，从而调节基因的表达。为了研究FTO在自闭症中的分子机制，课题组用oe-FTO或sh-FTO治疗EN2-/-小鼠大脑皮质神经元。WB和免疫荧光结果显示，FTO过表达FTO降低了细胞中m6A的修饰水平，而敲除FTO则逆转了这一水平。考RT-PCR和WB结果显示：FTO过表达增加了小鼠大脑皮质神经元中PGC-1α的mRNA和蛋白水平，而FTO的敲低则逆转了这一水平。进一步的RT-PCR结果显示：FTO过表达增强了PGC-1α mRNA的稳定性，而FTO敲低诱导了PGC-1α mRNA的降解。以上数据表明，FTO通过去除m6A修饰来稳定PGC-1α的表达。

图3| FTO抑制PGC-1α的m6A修饰并稳定其表达

随后，课题组检测了PGC-1α对小鼠大脑皮层神经元凋亡的影响。WB结果显示：oe-PGC-1α和sh-PGC-1α导致神经元中PGC-1α蛋白表达增加和降低。流式细胞仪数据显示，PGC-1α过表达和低表达分别抑制和促进了神经元凋亡。此外，PGC-1α增强了UCP1启动子的荧光素酶活性， ChIP-qPCR和WB实验证明：PGC-1α直接与UCP1的启动子区域结合；而过表达和下调PGC-1α可分别促进和抑制UCP1蛋白的表达，而进一步过表达UCP1基因增加了UCP1的蛋白表达，而没有影响PGC-1α的蛋白表达。流式细胞仪分析结果显示，下调PGC-1α可促进神经元凋亡，而过表达UCP1可以挽救神经元凋亡。进一步的WB实验结果表明：PKCβ通过激活FTO/PGC-1α/UCP1轴来抑制EN2-/-小鼠大脑皮层神经元凋亡。

图4| PGC-1α通过转录激活UCP1来抑制EN2-/-小鼠大脑皮层神经元中的神经元凋亡

最后，课题组发现使用sh-UCP1抑制UCP1表达后阻止了oe-PKCβ对EN2-/-小鼠的自闭症样行为和细胞过度凋亡的缓解作用，进一步的WB结果显示：oe-PKCβ处理促进了PKCβ、FTO、PGC-1α和UCP1蛋白的蛋白表达。这些结果表明PKCβ通过激活FTO/PGC-1α/UCP1轴来减少EN2-/-小鼠的自闭症样行为。

图5|抑制UCP1的表达阻止了oe-PKCβ对EN2-/-小鼠的自闭症样行为的缓解作用

总的来说，本文发现PKCβ可能通过上调FTO/ PGC-1α/UCP1轴来抑制小鼠大脑皮质神经元的凋亡，改善EN2-/-小鼠的自闭症样行为。这些结果可能为自闭症的治疗提供新的见解。

文章来源

 https://doi.org/10.1002/jbt.23236

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