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2023年7月13日以色列阿里尔大学分子生物学系Moshe Szyf研究团队在Nature子刊neuroscience bulletin发表论文“Methyl-CpG binding domain 2 (Mbd2) is an epigenetic regulator of autism-risk genes and cognition”，揭示了甲基-CpG结合域2（Mbd2）是自闭症风险基因和认知的表观遗传调控因子。
甲基-CpG结合结构域蛋白家族与神经发育障碍有关。甲基-CpG结合域2（Mbd2）与甲基化的DNA结合，并在癌症和免疫中发挥重要作用。一些证据表明这种蛋白质与神经发育有关。然而，它在神经发育和大脑功能中的确切作用大多是未知的。在这里，作者发现小鼠的Mbd2缺陷会导致认知、社会和情绪功能的缺陷。Mbd2结合了海马区神经元基因的调控DNA区域，Mbd2的缺失改变了数百个基因的表达，并显著下调了神经元基因相关通路。此外，全基因组DNA甲基化分析发现，Mbd2−/−小鼠神经元基因调控DNA区域的DNA甲基化模式发生了改变。差异表达的基因与在自闭症谱系障碍（ASD）个体的大脑中观察到的基因表达变化显著重叠。下调的基因在人类同源ASD风险基因中显著富集，观察到的海马形态学异常和ASD患者相似。
图一 Mbd2缺乏症的行为影响
先前对Mbd2−/−小鼠行为的研究发现，母性行为受损。在雄性Mbd2−/−小鼠中发现，存在活动能力减退、筑巢行为受损和轻度空间学习和记忆障碍。作者进一步测试了Mbd2是否参与了学习行为，对雄性和雌性小鼠进行了测试，发现性别对测量的任何行为都没有显著影响。在WT小鼠中，运动和探索行为没有变化。Mbd2−/−小鼠的自我梳理时间和梳理次数显著增加，作者对几种形式的记忆也进行了测试。通过在Y迷宫的自发活动来评估短期工作记忆，发现在Mbd2−/−小鼠中是完整的，两组间在不同臂进入的次数没有差异，表明Mbd2−/−小鼠的探索行为正常。Mbd2−/−小鼠在长期物体位置记忆测试中表现出记忆保留受损。一些神经发育障碍的小鼠模型在三室测试中显示出正常或接近正常的行为，而在社会互动测试中显示出社交性降低。这些数据表明，社会互动测试比三室测试更敏感，因为它允许在场的小鼠之间进行直接的身体互动和探索。因此，作者使用了社会交互测试，发现Mbd2−/−小鼠的社会互动时间减少。作者还测试了小鼠在明暗箱中的焦虑样行为，发现Mbd2−/−小鼠在明箱中花费的时间更少，这表明焦虑水平更高。结果表明Mbd2参与调节认知、社会和情绪行为。
图二 由ChIP-seq解析的Mbd2结合图谱
研究中受影响的行为涉及海马体功能，MBD蛋白家族的其他成员在海马功能中起着重要作用。作者对WT和Mbd2−/−动物进行了Mbd2测序，以确定Mbd2结合位点，鉴定出2782个Mbd2峰涉及461个基因。Mbd2主要结合在含CpG和富含gc的DNA区域。转录因子E2F8和NFAT5在Mbd2结合峰中高度富集，NFAT家族成员在已知的基序富集分析中也被富集。E2F和NFAT家族在神经发生和大脑发育中起作用。作者还将研究小组的数据与公开获得的小鼠海马组蛋白标记的ChIP-Seq数据进行了比较。Mbd2整体结合结合更多抑制性组蛋白标记的区域，而不是结合活性组蛋白标记的区域。然而，有一部分峰与同时具有活跃和抑制性组蛋白标记的区域结合。Mbd2与启动子、3'-utr、TTS和外显子上的共同占据富集活跃的组蛋白标记，而从抑制性组蛋白标记中耗尽，这与这些基因组特征的激活作用相一致。GO富集的通路分析显示，Mbd2在几个神经元和大脑相关通路上的富集，包括突触组装和轴突引导。Mbd2峰在脑相关通路中表达丰富，包括：轴突引导、轴突发生和化学突触传递的调节，从而进一步支持了Mbd2在神经元发育中的作用。这些数据表明，Mbd2参与了这些神经元特异性启动子的转录起始的激活。
图三 Mbd2缺失对基因表达和DNA甲基化的影响
为了进一步阐明Mbd2在海马基因表达中的作用，作者探究了WT和Mbd2−/−小鼠的转录组。在Mbd2−/−小鼠中发现了2907个差异表达基因，其中1590个基因表达上调，1317个基因表达下调。GO富集分析发现涉及神经元相关通路如神经元投射发育、跨突触信号通路和行为。相反，上调的基因在稳态和代谢相关通路中富集。16个具有Mbd2峰值和mRNA水平下调的基因富集：它们也可能在维持DNA甲基化/去甲基化转换中发挥作用。Mbd2缺失会导致调节区域的高甲基化，进而导致基因表达的下调。因此，作者测试了mbd2缺失是否会改变海马DNA甲基化。作者通过靶向双硫酸测序对Mbd2−/−和野生型小鼠海马中调节DNA区域的甲基化状态进行了单碱基化测序。对所有已测序CpG的甲基化水平分布的分析显示，通过ChIP-seq定义的WT小鼠中的Mbd2结合区域在Mbd2−/−小鼠中被高度甲基化，在全基因组分析中，检测了Mbd2结合区域外的DNA，也观察到Mbd2缺失导致的高甲基化，DNA甲基化的变化发生在Mbd2峰以外的区域，Mbd2缺失可能间接影响DNA甲基化。在Mbd2−/−小鼠中，Tet2、Dnmt3a、Mbd1和Mecp2的表达显著降低。部分甲基化的基因代表了一组可能是异质甲基化的基因在海马细胞核中呈异质性表达，Mbd2可能调控这些基因的甲基化状态。作者评估了Mbd2结合如何影响Mbd2结合基因单CpG分辨率的DNA甲基化。结果表明，甲基化状态与其表达不呈负相关的基因，受到不受DNA甲基化抑制的转录因子的调控。
图四 Mbd2−/−小鼠海马转录组、精神疾病中大脑转录组和ASD风险基因之间的重叠
作者发现Mbd2−/−小鼠和ASD个体的差异调控基因之间存在显著的重叠。在Mbd2−/−小鼠中，下调基因与精神分裂症患者中下调基因之间存在显著的重叠。没有发现与双相情感障碍差异表达的基因有任何显著的重叠。Mbd2−/−小鼠与ASD个体之间的基因表达倍数变化水平呈显著正相关，但Mbd2−/−小鼠与精神分裂症或双相情感障碍患者之间没有显著正相关。接下来，作者将作者的基因表达数据与两个人类ASD风险基因数据库进行了比较：在Mbd2−/−小鼠中发现ASD风险基因和下调基因之间存在明显的重叠。65个ASD风险基因中，有24个在Mbd2−/−小鼠中下调。在Mbd2−/−小鼠中，65个基因列表中只有3个基因表达上调。Mbd2−/−小鼠和人类中24个常见的下调基因也形成了一个显著的蛋白相互作用网络与一些与“生物和细胞过程的调控”和“神经系统发育”相关的顶级GO通路。接下来，作者将RNA-seq结果与ASD相关基因列表进行了比较，该基因列表包含了所有已知的与ASD相关的人类基因。在951个与ASD相关的人类基因中，有125个表达下调，而在Mbd2−/−小鼠中，只有44个表达上调。对mbd2调控的asd相关基因列表的分析显示了显著的蛋白-蛋白相互作用富集。综上所述，这些转录组和基因组跨物种比较分析表明，Mbd2可能作为许多ASD相关基因的上游调控因子。即Mbd2在癌细胞系中的肝脏、乳腺癌和前列腺癌基因中起调节作用，在海马细胞中起调节作用。
图五 病毒介导的Mbd2下调
接下来，作者探究海马Mbd2是否参与对成年Mbd2−/−小鼠受损行为的调节以及在成年小鼠中Mbd2的下调是否会影响Mbd2−/−小鼠的部分或全部行为变化，这些小鼠在胚胎发生和出生后发育过程中都缺乏该基因。病毒注射以敲除Mbd2，在注射部位附近和CA3的齿状回发现了病毒表达，在注射和恢复后，在Mbd2−/−小鼠中进行了行为测试。下调Mbd2并不影响运动能力，但增加了自我梳理时间和平均梳理回合持续时间。Mbd2下调导致治疗小鼠在物体-位置-记忆测试中无法记住物体的位置。社交互动测试中的互动时间不受Mbd2下调的影响，在明暗灯箱测试中，Mbd2下调的小鼠表现出焦虑增加，表现为在明室中的停留时间减少，这些结果表明，成年小鼠海马Mbd2敲低再现了Mbd2−/−小鼠中发现的大部分行为异常，但不是社交互动缺陷。
越来越多的证据表明表观遗传机制在神经心理疾病和中枢神经系统功能中发挥着至关重要的作用。该研究探究了Mbd2在基因表达和大脑功能中的作用。Mbd2与其他MBD蛋白一样，充当表观基因组的“阅读器”，将DNA甲基化标记翻译为基因表达调控机制。使用单细胞多组学和细胞类型特异性测序和体外神经元培养工作，完善对Mbd2在不同细胞类型、脑区和海马亚域中的作用及其与ASD样行为的关系。虽然没有发现性别对行为的任何影响，但相似的行为表现型可能是男性和女性之间不同的基因表达调节网络的结果。因此，作者认为即使是在观察到的行为表现型的相似性的情况下，未来的研究应该将性别作为体外实验的生物学变量。
https://www.nature.com/articles/s41398-023-02561-9
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