免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学
敏感性高，特异性高
染色方法
标记物性质：
荧光法（荧光素标记）
酶法（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶）
免疫金银法
染色步骤：
直接法（一步法）
间接法（二步法、三步法或多步法）
结合方式：
抗原抗体结合，如PAP（过氧化物酶-抗过氧化物酶）法，标记的葡聚糖聚合物（LDP）法。最常使用LSAB法和LDP法
两步LDP法即Envision法即ELPS法 (enhance labeled polymer system)
检测系统：
最常用辣根过氧化物酶（HRP）-二甲基联苯胺（DAB），阳性呈棕色细颗粒状。
HRP-DAB呈棕色，中性树胶封片
HRP-AEC呈红色，甘油封片
AKP-BCIP/NBT呈深蓝色，中性树胶封片
*HRP，Horseradish Peroxidase 辣根过氧化物酶
DAB，Diaminobenzidine，3，3--Diaminobenzidine 二甲基联苯胺
AEC，3-Amino-9-ethylcarbazole 3-氨基-9-乙基咔唑
AKP（ALP），alkaline phosphatase 碱性磷酸酶
BCIP，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐
NBT，Nitrotetrazolium Blue chloride 氯化硝基四氮唑盐
免疫组化全程操作
一 固定、脱水、包埋
在包埋盒上写好标签；
取组织（正常阳性对照、正常阴性对照和实验组）于相应的包埋盒内，置4%多聚甲醛固定3-24小时。
修切组织至合适部位，再放入包埋盒中。
水洗30~60分子钟，或不洗；
脱水：（先打开包埋机电源，并设置蜡温）
75%酒精30分钟、805酒精30分钟、90%酒精30分钟、95%酒精两次各30分钟、无水乙醇两次各30分钟、无水酒精-二甲苯等量混合液30分钟（或省）、二甲苯透明两次各30分钟、二甲苯-石蜡液等量混合30分钟（可省）。
透明的组织放入第一缸蜡液30分钟；
放入第二缸蜡液30~45分钟；
将浸蜡的组织包埋。
选大小合适的包埋模具，往模具中注满包埋蜡液，打开包埋盒盖子，用镊子取出组织放入模具中。
移入冷台冷却，从模具中取出蜡块。
二 切片
在防脱免洗载玻片一端写上标本编号。
打开摊烤片机电源，调整水温45~50℃，烤片温度60~70℃。
打开切片机，固定蜡块(可提前4℃冰箱预冷一下)，调整刀片和蜡块的距离。转到修切状态，调整切片厚度（10~20㎛），先粗切，看到完整的蜡片并且有组织后，切换至切片状态，调整切片厚度（3~5㎛）。用力均匀，右手摇动切片，左手用毛笔接片。如片子打卷，可以用毛笔按着蜡片的边缘再缓慢切，这样可以得到相对平整的片子。
用毛笔和镊子将片子或者带状片子托起，放入冷水中，将切片分成单片；
将蜡片移入45~50℃热水中，将蜡片摊平。
用防脱片载玻片轻轻捞起，载玻片的边缘尽量不要触碰水槽底部，防止底部气泡上浮残留在片子上。
然后展好的切片放入烤片区烤片60分钟。
三 组织化学染色
染色前先将切片烘干30分钟
（一）脱蜡、水化
二甲苯脱蜡两至三次，每次5分钟；
无水乙醇洗涤两次各1分钟；
95%酒精、90%酒精1分钟、80%酒精、70%乙醇1分钟。
蒸馏水洗3次各3分钟，PBS洗3次各3分钟。
（二）热抗原修复
换新的切片架，放入水化后的切片。配置抗原修复液(一包柠檬酸钠粉末配置2升PBS溶液)，用铁饭盒或者锅加热煮沸。温度控制在96~98℃。然后将切片放入热锅中15分钟，最后自然冷却室温。
PBS洗2次各5分钟，蒸馏水洗2次各3分钟。
免疫组化笔画圈:取出组织，甩干水分，可用吸水纸吸干水珠。用组化笔画圈围住组织，圆圈完整。
（三）灭活内源酶活性
将切片放入湿盒中，盒中加入少量蒸馏水，滴加3%过氧化氢(二抗试剂盒中A一滴或者50微升)，室温孵育10分钟。PBS洗3次各3分钟，蒸馏水洗涤3分钟。
（四）封闭非特异性位点
甩干水分，吸干水珠，加山羊血清封闭液(二抗试剂盒B一滴或者50微升)，放入湿盒内，室温10分钟。
甩掉封闭液，滴加一抗盖住组织，然后放入湿盒内4℃过夜。(一抗浓度提前稀释后分装，并在-20℃冰箱保存。每张片子一抗剂量不定，看组织面积大小，xxxxx癌组织一张20微升左右。
第二天，4℃冰箱取出湿盒，室温复温30分钟，PBS洗3次各3分钟，蒸馏水洗涤3分钟。
甩干水分，吸干水珠，滴加二抗(二抗试剂盒C)一滴或者50微升，室温孵育10分钟。PBS洗3次各3分钟，蒸馏水洗3分钟。
每张片子滴加一滴或者50微升链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(二抗试剂盒D)，室温孵育10分钟，PBS洗3次各3分钟，蒸馏水洗3分钟。
每张片子滴加两滴或者100微升DAB溶液，显微镜下观察3-10分钟。染色合适即可终止染色，自来水冲洗。
苏木精染液复染1~2分钟至细胞核变蓝色，自来水或者PBS冲洗。
如用1%盐酸酒精分化3秒，自来水洗3分钟或用0.5%氨水反蓝。
五 脱水
70%酒精1分钟、80%酒精1分钟、90%酒精1分钟、95%酒精2次各1分钟、无水酒精2次各2~3分钟，可用石炭酸二甲苯脱水5分钟，二甲苯透明2~3次各2~5分钟。
六、封片和照相
滴加适量中性树胶封片，盖上盖玻片，小心气泡。显微镜下拍照。
PAP法
（1）标本固定后，PBS洗涤；
（2）1%H2O2（或1%H2O2甲醇）阻断内源性过氧化物，室温10～20分钟；
（3）PBS洗2次，每次3分钟；
（4）正常血清（二抗的正常血清）孵育，室温20分钟；
（5）滴加一抗，室温1小时或4℃过夜；
（6）PBS洗3次，每次3分钟；
（7）滴加二抗，室温30分钟；
（8）PBS洗3次，每次3分钟；
（9）加PAP复合物，室温60分钟；
（10）PBS洗涤3次，每次3分钟；
（11）0.04%DAB+0.03%H2O2显色5～10分钟；
(12）充分水洗；
(13）苏木精复染，封片观察。
酶标聚合物法（labelleddextranpolymer，LDP）法
EnVision法
(1)4㎛常规石蜡切片经烤片后，常规二甲苯、乙醇脱蜡至水，PBS洗3分钟各3次。
(2)预处理组织切片(可用酶消化或AR或不作任何处理，依一抗质量而定)。
(3)PBS洗3分钟各3次。
(4)0.3%H202阻断内源性过氧化物酶15分钟，PBS洗3分钟各3次。
(5)适当稀释特异性一抗，37℃孵育30分钟，PBS洗3次各3分钟次。
(6)EnVision复合物(即用型)孵育30分钟，PBS洗3次各3分钟次。
(7)水洗，复染，常规树胶封片。
(8)结果观察。
LSAB法或SP法、SABC（streptavidin biotin complex）法
（1）石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3次各3分钟。
（2）IHC的前处理视特异性一抗不同，可采用蛋白酶消化或热诱导的微波抗原修复（AR），PBS洗3次各3分钟。
（3）3％过氧化氢孵育10分钟（可省略），以阻断内源性过氧化物酶活性。
（4）PBS洗3次各3分钟。
（5）10％非免疫性动物血清孵育10分钟（可省略），以减少非特异性背景，无需冲洗，只需吸去多余血清。
（6）滴加适当稀释的第一抗体，37℃孵育60分钟或4℃过夜。
（7）PBS洗3次各3分钟。
（8）滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30～60分钟。
（9）PBS洗3次各3分钟。
（10）滴加过氧化物酶标记的链霉亲和素，室温孵育30分钟。
（11）PBS洗3次各3分钟。
（12）0.04％DAB（含0.03％H2O2）显色5～10分钟。
（13）复染，脱水，常规树胶封固，结果观察。
染色结果
细胞膜线性阳性：大多数淋巴细胞分化抗原、钙黏连蛋白等；
细胞质阳性：细胞角蛋白（cytokeratin，CK），肝细胞特异性蛋白（Hep Par-1），某些中间丝蛋白主要分布在近细胞膜处的细胞质内；CD15和CD30等抗体的染色呈胞质内局限性点状阳性；
Bcl-2蛋白等定位于线粒体的抗原常表现为细胞质内弥漫性阳性；
细胞核阳性，如Ki-67、甲状腺转录因子（TIF-1）、雌激素受体（ER）蛋白，孕激素受体（PR）蛋白
有些抗体同时在细胞质和细胞核内表达，如EMA可呈细胞膜阳性和细胞质弥漫性阳性，CD15和CD30抗体同时呈细胞膜阳性和细胞质点状阳性
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