标题：Single-cell analysis defines a pancreatic fibroblast lineage that supports anti-tumor immunity
期刊：Cancer Cell
日期：2021-06-25
DOI：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.06.017
作者使用CyTOF对胰腺胆管癌（PDA）中CAF和免疫细胞的亚群进行分析,发现CD105显著地区分了两种不同地胰腺癌成纤维细胞表型。CD105-是”好人”,在胰腺癌中含量较少，促进抗肿瘤免疫，抑制肿瘤增殖。CD105+是”坏人”，在胰腺癌中含量较多，促进肿瘤生长。（更可贵的是这是一个表面蛋白！）
首先，先来科普一下如何区分出基质细胞？负向选择！作者使用Pdx1-Cre;KrasLSL-G12D/+;Trp53LSL-R172H/+; Rosa26LSL-tdRFP/LSL-tdRFP (RFPpos KPC) mice，去掉肿瘤细胞(RFPpos PCKhigh EpCAMpos)，免疫细胞(CD45pos)，内皮细胞(CD31pos),再加上一个CD90 marker。
作者使用CyTOF分析了来自于19个小鼠胰腺胆管癌（PDA）的5百万个基质细胞。然后作者排除免疫细胞和肿瘤细胞，单独对基质细胞进行降维分群。内皮细胞分为血管EC，淋巴管EC，周细胞和小亚群。对成纤维细胞进行分析，作者发现PDPN, CD90, DES, and CD63等marker都不能很好的标记所有CAF。(Fig1A-C) 而细致地看（作者就直接这么说了）发现TGF-β受体复合物之一的CD105能很好将CAF分为俩群,CD105pos:CD105neg大概是7：3。(Fig1D,E) 但CD105neg的Ki67表达更多，作者认为其增殖能力更强。而凋亡上（CC3）没有区别。(Fig1F,G) 而MHCII和CD74在CD105neg中高表达意味着抗原递呈CAF（apCAF）应该被包含在CD105neg中。(Fig1I,J) 对基质细胞丰度进行相关性分析，发现CD105pos和CD105neg有明显的区分。
为了研究CAF对免疫细胞增殖/凋亡的影响，作者先计算了每个细胞群中增殖细胞的比例(%Ki67pos IdUpos cells)和凋亡细胞的比例(%CC3pos cells)。(Fig2A,B) 然后研究CAF亚群丰度与免疫细胞增殖/凋亡的关系。作者发现S-9亚群 (CD105neg MHCIIpos CD74pos)与抗原相关CD4 T细胞（T-19) 和激活但尚未耗竭T-3亚群（PD-1int CD39pos CD38neg GZMBpos CTLA-4pos 4-1BBpos T-BETpos)的增殖相关。而CD105pos αSMAhigh CAF则与T-19和T-10的增殖负相关（Fig2C-H）体现了CD105neg和CD105pos与免疫截然不同的关系。(Ps：这个思路很有意思，作者没有直接用免疫的丰度和CAF的丰度做相关性，也没有用Cellphone等细胞间通讯的软件。)
之前都是在小鼠中研究，在人的肿瘤中能不能也分出这俩群呢？当然可以(Fig3A,B)
为了在小鼠的肿PDA中进一步验证CD105 pos和neg是截然不同的俩群CAF，作者用FACS分选出这俩群然后进行了RNA-seq。（Fig3C-P）作者发现这两种细胞表达等量的经典CAF marker，经典的myCAF和iCAF marker表达也没有差异。但是FAP和Ly6c1在CD105pos中表达较高，其在CD105neg中也有表达，只是变化很大。
作者对两者进行差异分析，发现TGFβ通路在CD105pos CAF中富集而TNFα，NF-κB通路，IL6通路，JAK2通路，STING通路在CD105neg CAF中富集。（Fig3K-M）除此之外，它们俩也分别差异表达了一些外泌蛋白。（Fig3M-O）另外，作者还发现CD015neg 高表达一些间皮细胞相关基因。（Fig3P） (PS：用RNA-seq数据做了好多张正文的图，倒是人PDA的scRNA-seq数据全放补充材料了)
这是一个相当有趣的问题！
打个比方：谱系就好像人的性别，不管环境如何影响都不会变。而表型就好像人的性格，随着生活环境的不同而变化。
再在具体到成纤维上，举个例子，谱系指的是皮肤成纤维和血管成纤维的区别，它们在胚胎期就被赋予了不同的分化轨迹。而表型指myCAF和iCAF的区别，可能是一种细胞的两种状态（state)。那我们用CD105是一种谱系marker还是表型marker呢？
作者研究发现正常人的成纤维也分为CD105neg和CD105pos两群（Fig4A），且在用肿瘤培养基处理，和肿瘤细胞共培养后其数量（即CD105的表达）不会发生变化。（Fig4B,C）且在癌旁也能显著分出两群（Fig4D）
分别加入17种成纤维细胞marker的刺激调节因子对CD105的表达会不会有影响呢？几乎没有，只有TGFβ稍微增加了CD105pos的比例而TNFα，INFγ稍微增加了CD105neg的比例。（Fig4E,F）但是我们能看到这些因子显著的改变了其他CAF marker的表达，即CAF的表型发生了很大转变。作者单独验证了IFNγ信号能提高CAF中MHCII，CD74，CD80的表达，但是几乎不能改变CD105。
总结上述研究，朋友们，你们觉得CD105是一种什么marker？可以在下面留言。
作者使用流式观察了不同刺激条件下正常组织中CD105pos和CD015neg各通路基因的表达情况。发现两者对各种信号的反应不同，提示两者内在调控通路的差异。（Fig5A）
之后作者进一步用TGFβ1，IL1α，IFNγ对正常组织内成纤维细胞进行6h刺激，观察两种不同CAF对刺激的反应差异。作者发现CD105pos对TGFβ和IL1α的信号有着强烈的响应，而对于TGFβ的响应有一部分基于CD105这个TGFβ受体的复合体。对于IFNγ两者响应程度倒是相同，但各自有一些独特的差异基因，说明下游的反应有差别。
之前我们发现myCAF和iCAF在CD105 pos和neg 成纤维细胞中都存在，意味着正常的CD105 pos和neg都能变成myCAF或iCAF。作者进一步猜想TGFβ和IL1α在长期处理（72h）中诱导myCAF和iCAF的能力会不会有差异？结论是没有差异。
综上，CD105pos和CD105neg 成纤维细胞对早期TGFβ1刺激和IL1α刺激的响应有着明显区别（有可能是配体的数量差异导致），但都有着长期诱导后变为myCAF和iCAF的能力。
(PS：这里的思路也很有意思。Fig4侧重于说明刺激前后成纤维细胞的变化，这里变量主要是刺激。而在Fig5中变量主要是细胞类型。刚好从两种角度搞明白了两个问题。)
作者皮下构建了胰腺癌小鼠模型，之后分别注射带有荧光的CD105 pos和neg的正常成纤维细胞（为啥不注射CAF呢）。（Fig6A）能看到，注射CD105pos 成纤维细胞对肿瘤生长没有显著影响，但是注射CD105neg 成纤维细胞可以显著抑制肿瘤生长。（Fig6B,C）甚至如果1:1混合两者还能抑制肿瘤生长。而这中现象在免疫缺陷小鼠中并不存在（Fig6D,E）而在B6.Batf3（cDC1缺陷）小鼠中，此现象也被削弱很多。（Fig6F）说明CD105neg抑制肿瘤生长是依赖免疫反应的。
之前作者发现CD105neg CAF高表达MHCII相关分子，那其肿瘤生长是不是依赖MHCII相关分子的呢？但作者敲除MHCII相关分子后其仍有抑制肿瘤生长的能力。（Fig6G）然后作者想进一步探究CD105neg 成纤维细胞抑制肿瘤作用是否依赖CD105表达，因此在CD105pos 成纤维细胞中沉默掉CD105，发现沉默后对肿瘤抑制效应没有影响。
注射CD105neg成纤维细胞对肿瘤微环境有啥影响呢？作者取注射10 天后肿瘤进行RNA-seq。（Fig6H-J）在CD105neg注射的样本中，Cd3d，Lck等T细胞浸润相关分子显著高表达、DC抗原呈递相关分子显著高表达。通路富集也富集在免疫相关通路上。
为了拓展研究的适用范围，作者使用流式细胞术研究了小鼠18个正常组织，都发现了CD105pos 和CD105neg的成纤维细胞亚群，而其丰度在不同器官间不同（Fig7A）而作者还进一步探究了小鼠中5种肿瘤20个样本中的CAF。首先，作者发现肠癌和胰腺癌的CAF聚在一起，而其他癌种分别聚类，体现了这两种癌种的相似性，其次，作者发现没有一种marker能标记所有的CAF。而最重要的是CD105neg CAF在乳腺癌和肠癌中较多，而CD105pos CAF在肺癌和黑色素瘤中较多。而作者在人肿瘤的FPPE切片中用免疫荧光验证了上述结论。
这篇文献是研究CAF与免疫的经典文献之一。胰腺癌中有很多CAF方向的经典文章，最早的myCAF和iCAF分群应该就是源自胰腺癌的研究，而apCAF也是在胰腺癌中发现。这篇文献与他人最大的不同还是作者对”谱系“的思考与一个”好人“CAF的发现。而进来越来越多的文章以CAF亚群为突破点冲击顶刊，值得关注。
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