作者：孙天宇，南京农业大学博士在读，主要研究核心链霉菌介导的根际抑病菌群互作与调控机制。
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病原菌入侵会对植物的健康生长产生不利影响。但植物可以动态调节其根际微生物群落来适应这种生物胁迫。虽然植物招募的有益微生物可以人为组装成合成菌群用于植物病害的防治，但根际微生物群落常包含一些丰度较低的种群，这些低丰度微生物种群的作用尚不明确。是否所有由植物富集的微生物均能增强其对环境的适应能力？因此，本研究基于根际相关细菌群落的组成差异分析，构建具有抗病功能的合成菌群，通过简化该合成菌群探究低丰度微生物种群对于蒙古黄芪根腐病的防治作用。结果表明，尖孢镰刀菌的侵染降低了蒙古黄芪根际和根内细菌的多样性和群落组成。在病原体侵袭下，植物向根际和根部招募了一些有益菌。本研究构建了含有10个高丰度和3个低丰度细菌的抗病合成菌群。经植物和病原体的共同选择，合成菌群被进一步被简化为由三种高丰度细菌 (寡养单胞菌属，根瘤菌属和苍白杆菌属) 及一种低丰度细菌 (小陌生菌属) 组成的简单群落。值得注意的是，4个成员的简单群落与13个成员的群落对于根腐病防控效果相似。此外，简单群落可通过高丰度细菌抑制病原菌的生长，低丰度细菌激活植物诱导的系统抗性来保护植物。本研究发现，低丰度细菌在合成菌群中起重要作用，只有少数在病根中富集的细菌类群与抗病性有关。结果表明，合成菌群的构建和简化可能是植物适应环境压力的一种策略。如图1所示，假单胞菌属，寡养单胞菌属，泛菌属和金黄杆菌属在病根的细菌群落中有相对较高的丰度，而癣囊腔菌属，头束霉属和镰刀菌属在病根真菌群落中具有较高的丰度。前期研究表明，青枯劳尔氏菌，人参锈腐病菌，尖孢镰刀菌，茄腐镰刀菌，链格孢菌和疫霉菌是造成根腐病的潜在病原体。然而，在高丰度OTU中，并未观察到在病根聚集的已知属的潜在致病细菌 (图1a)。反之，镰刀菌属 (8.79%) 和链格孢菌属 (1.30%) 是病根中相对丰度较高的真菌类群 (图1b)。镰刀菌属在病株根部显著富集，但链格孢菌属在健康和病株之间无显著差异 (图1c，1d)。此外，从患病植株中分离出53株可培养真菌，包括尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌和烟草赤星病菌等。盆栽结果显示，仅尖孢镰刀菌处理发病率高，植株表现出典型的根腐病症状：叶片卷曲、植株矮小、根系褐变、腐烂(图1e，1f)。因此，将该菌作为后续实验的指示病原菌。图1 病株根际微生物的群落组成及病原真菌的致病力
16S rRNA扩增子测序结果表明，本研究共聚类成7547个细菌OTU，序列一致性≥97% 在健康和病根中发现的大多数细菌OTU存在于根际。然而，也有相当大比例的细菌仅在患病的根际和根系被检测到(分别为9.2%和0.6%)，尽管与患病植物相关的大部分OTU也存在于健康植物的根际和根内。图2a显示，尖孢镰刀菌存在与不存在的情况下，细菌群落的Shannon多样性从土体土到根系逐渐降低 (健康根:F2, 33 = 90.96, P ＜0.001;病根:F 2, 33 = 84.78, P＜0.001)，这表明植物对于细菌的根际定殖具有很强的选择作用。此外，尖孢镰刀菌的入侵降低了根内细菌群落的Shannon多样性，但对土体土和根际微生物α多样性无影响 (根际:F1, 22 = 0.48, P＜0.50; 根:F1, 22 = 9.71, P=0.005)。PCoA图揭示了健康和患病植株根和根际细菌群落组成的显著差异。此外，健康根与患病根的内生菌群落组成差异大于根际差异(根:R2=0.25, P=0.001; 根际:R2=0.10, P=0.011) (图2b)。三元图还显示，病根和根际中丰富的细菌OTUs数量与健康植株有显著差异 (图2c)。然而，在土体土样品中没有观察到差异。结果表明，在尖孢镰刀菌胁迫下，植物招募了一定数量的微生物在根际和根部定植。图2 尖孢镰刀菌对根际和根系相关细菌群落结构的影响
OTU分类结果显示，根系和根际土壤细菌群落以变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为主，占总reads的86.7 ~ 98%，而土体土的细菌群落以变形菌门(30.4%)、放线菌门(25.6%)、酸杆菌门(13.1%)和绿杆菌门(8.8%)为主(图3a)。与土体土相比，根际显著富集变形菌门和放线菌门，而根系明显富集变形菌门。植物感染尖孢镰刀菌也会影响根相关菌群组成。在根内受病原菌侵染影响显著的细菌门为变形菌门和拟杆菌门，根际则为放线菌门和拟杆菌门。然而，土体土中细菌门的丰度不受镰刀菌的影响 (图4)。在属水平上，土体土中最多的细菌属为类诺卡氏菌属 (3.9%)、节杆菌属 (3.8%)和盖亚女神菌属(2.8%)。相反，根际优势属为节杆菌属和寡养单胞菌属，根内优势属为假单胞菌属、寡养单胞菌属和泛菌属(图3b)。前40个属的热图显示，健康根系和患病根系的细菌群落是分开聚集的。然而，健康植株和患病植株的根际细菌群落无法区分(图3c)，这表明尖孢镰刀菌侵染对根系细菌群落结构的影响比对根际细菌群落结构的影响大。为了研究病原菌侵染时，哪些细菌被植物根系招募，本研究分析了健康植物和患病植物之间的差异细菌。结果表明，病株根系中寡养单胞菌、假单胞菌和黄杆菌属被高度富集(图5a)，而根瘤菌科和黄杆菌目在患株根际被富集。图3 健康与患病植物不同部位间的植物相关细菌群落组成
图4 真菌病原菌对健康和患病植物细菌组成的影响
16S rRNA测序结果显示，病根的细菌群落组成与健康根有显著差异。为了研究从患病植物中招募的细菌是否会改变细菌群落的功能特征，本研究首先通过PICRUSt软件预测了细菌群落的功能。细菌群落功能谱在健康根际和患病根际之间存在差异。病株的根际和根系中，这些功能与“环境适应”、“细胞运动”、“信号转导”和“次生代谢物的生物合成”有关(图5c，5d)。接下来，分析了病根中富集的OTUs与病原真菌的关系。相互作用网络分析结果表明，寡养单胞菌、黄杆菌和假单胞菌的丰度与尖孢镰刀菌的生长呈负相关(5b)。图5 病原菌感染后细菌群落的分类和功能特征
为进一步评价招募的细菌对黄芪健康的影响，本研究分别从健康和患病黄芪的根际和根中分离出来自74个属的423株细菌，分别具有溶解有机P和无机P，溶解K，产生IAA等功能。其中病根中有39个细菌属富集，137个细菌属减少。病原菌侵染导致根内细菌属如假单胞菌、寡养单胞菌、金黄杆菌、无色杆菌属和黄杆菌属显著增加，泛菌属、副芽殖单胞菌属和微杆菌属减少(图5a)。本研究从39个富集属中分离出16个菌属，从137个减少属中分离出11个菌属，每个属包含2~8个种。根据它们的拮抗或促进植物生长的特性从10个高丰度(＞0.1%)和3个低丰度属(＜0.1%)分别筛选出1个物种。然后将所有物种与等体积的悬浮液(~ 108个细胞/L)混合，构建合成群落I (SCI)。为了研究富集的微生物能否防止病原真菌侵染黄芪，本研究还选择了相对丰度降低的9个物种和4个随机物种构建的合成群落II (SCII)(图6a)。两种合成菌群处理植株生长20 d后，SCI处理植株的根长分别比未接种和SCII处理的植株长70.50%和54.33%，而SCI处理的株高分别比对照和SCII处理的株高高34.48%和20.56% (图6b，6c)。SCII处理的根长和株高与对照无显著差异。此外，SCI和SCII处理均未影响植株鲜重、干重和叶绿素含量(图6d，6e)。盆栽结果表明，SCI和SCII对根腐病发病率有不同的影响(图6f，6g)。接种病原菌12 d后，SCI显著降低发病率；接种后20 d，SCI处理的植株平均发病率和死亡率分别比对照低26.32%和23.64%。图6 合成细菌群落组装及其对黄芪根腐病的调控作用
SCI接种于土壤中30 d后，根系和根际中仅寡养单胞菌、根瘤菌、小陌生菌和苍白杆菌可以恢复。其中寡养单胞菌为优势种(图7a)。然而，有趣的是，4种微生物组成的简单群落(SCIII)也可以降低根腐病发病率和植物死亡率(图7b)。此外，SCI和SCIII处理的病苗数量显著低于对照和SCII处理。SCI和SCIII处理的病苗数量无明显差异(图7b)。本研究在构建简化的合成菌群时，测试了不同比例的高丰度菌群和低丰度菌群的混合防治效果。结果表明，减少小陌生菌属和苍白杆菌属的数量不影响简化合成群落对黄芪根腐病的防控作用(图7c)。图7 合成菌群I的简化及疾病防控效果
寡养单胞菌可直接抑制真菌菌丝体的生长；然而，小陌生菌属、根瘤菌属和苍白杆菌属对尖孢镰刀菌生长的负面影响最小，这与网络图结果一致，表明寡养单胞菌、黄杆菌和假单胞菌的丰度与病原菌呈负相关（图5b，7d）。尽管用小陌生菌属、根瘤菌属和苍白杆菌属处理的真菌病原体在生长6天后的菌落半径小于对照真菌的菌落半径，但在第10天没有观察到抑制作用。有趣的是，SCIII和单独的寡养单胞菌对病原菌的抑制效果相似，这表明SCIII对真菌生长的抑制作用并没有因为添加三种细菌而增加。因此，本研究推测寡养单胞菌通过抑制病原菌的生长来保护黄芪，而其他三个菌株则通过不同的方式阻止病原菌入侵黄芪。寡养单胞菌是SCIII中唯一可以抑制病原菌生长的细菌，而其它三株细菌在病害防治中是否发挥作用？因此，本研究通过使用单一菌株与SCIII进行比较，研究其对发病率的影响。虽然四种细菌都能显著降低植物死亡率，但寡养单胞菌属，根瘤菌属，和苍白杆菌属并没有显著降低根腐病发病率(图8a，b)。只有小陌生菌属 (丰度最低)显著降低了植株病害的发病率和死亡率，而SCIII的防病效果最好，表明合成菌群优于单株菌的作用。此外，所有处理均可促进植物生长。其中根瘤菌属，小陌生菌属和SCIII处理的植株株高和根长增长最多 (图8c，d)，而且，SCIII处理可显著提高植株干鲜重(图8e，f)。图8 接种SCIII和单一菌株对植物生长、根腐病发病率和死亡率的影响
研究发现，单菌、SCI和SCIII均显著提高植物内源茉莉酸(JA)的含量。虽然JA含量存在时间上的波动，但小陌生菌属和苍白杆菌属处理的植株JA含量高于寡养单胞菌属和根瘤菌属处理的植株。SCIII诱导的JA含量高于任何单一菌种。在接种合成菌群或单菌种后，检测了PAL、PPO和几丁质酶的活性。所有处理均逐渐提高PAL、PPO和几丁质酶活性，并在接种后168 h达到峰值。PAL、PPO和几丁质酶的活性在接种小陌生菌属.和苍白杆菌属的植株中高于接种寡养单胞菌属和根瘤菌属的植株；与CK(无任何处理)植株相比，根瘤菌属仅在72 h和168 h后诱导PAL的活性升高，在24 h后诱导PPO的活性升高。与CK对照相比，SCIII处理的PAL、PPO和几丁质酶活性分别提高了31.9%、40.8%和21.4%。SCI、SCIII和单菌种接种后8 h，POD和LOX酶活性均迅速提高，随后下降。在接种后168 h，POD和LOX活性达到最大值。与其他单菌和CK相比，小陌生菌属和SCIII均能显著提高植株中POD和LOX的活性。在接种后168 h，小陌生菌属和SCIII处理植株的POD活性分别提高了22.5%和29.4%，LOX活性分别提高了46.1%和39.7%。然后比较了SCI、SCII、SCIII、SCIII-10、SCIII-100和SCIII-600(高丰度和低丰度细菌混合比例为10:1、100:1和600:1)对植物ISR的激活。5d后，SCI、SCIII和SCIII不同配比处理植株的POD、PPO、PAL、LOX和几丁质酶活性无显著差异。SCII处理的所有酶活性均高于CK对照，但明显低于其他合成菌群处理(图9)。图9 不同合成群落对黄芪ISR的影响
利用新一代测序技术，本研究发现，病株的根内细菌群落组成与健康植株明显不同。尤其是在尖孢镰刀菌的胁迫下，植物根系招募了一些有益微生物，例如，假单胞菌属，寡养单胞菌属，金黄杆菌属，无色杆菌属和黄杆菌属等。其中，3个低丰度细菌和10个高丰度细菌在蒙古黄芪病根中富集，它们可以作为合成菌群成员而有效防控根腐病。以此为基础的简化版合成菌群，虽仅含4种细菌却保留原有的防控效果。进一步研究表明，高丰度的细菌主要靠抑制病原真菌的生长，而低丰度细菌主要与激活植物ISR缓解黄芪根腐病有关。研究结果表明，具有不同生态功能的细菌可以组合为合成菌群进行土传病害的防控。这种功能型合成菌群可以作为可持续农业的一种潜在的解决方案。论文信息
原名：A simplified synthetic community rescues Astragalus mongholicus from root rot disease by activating plant-induced systemic resistance
译名：简化的合成菌群通过激活植物诱导的系统抗性来拯救蒙古黄芪免于根腐病
期刊：Microbiome
DOI：10.1186/s40168-021-01169-9
发表时间：2021.11.04
通讯作者：李哲斐
通讯作者单位：西北农林科技大学生命科学学院
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