M1型巨噬是F4/80lowCD197+,是一类固有性的巨噬细胞，具有强杀菌效应，免疫刺激和肿瘤细胞毒性。M2型巨噬是F4/80highCD206+，是肿瘤侵润性的，具有抗炎症效应，促进组织生长与血管生成，促进肿瘤的发生发展，具有免疫抑制作用。M2型巨噬细胞也叫做肿瘤相关巨噬（TAM）。 * 肿瘤微环境相关免疫细胞的检测 一、背景介绍 流式细胞术（Flow Cytometry；FCM） 备注：具体原理构造等等一系列内容请阅读推荐书籍！ 艾森 NOVOCYTE （生物2楼或高新区） 目前国重实验室使用的两台基础流式仪： BD Calibur(药理2楼) 备注：使用前需联系负责人进行培训。 刘丽优点：BD是经典老牌的流式相关仪器试剂生产商。 缺点：1.机器型号老旧，电压不稳，使用人数超多，磨损大。 2.上机检测以及软件操作复杂，需专业培训并多次实 践操作。 3 .事后不能调节补偿。 优点：1.新机器，性能稳定。 2.傻瓜式操作，容易上手，软件操作数据分析简单。 3.可事后调节补偿 建议新手使用该型号。而且一个实验从始至终使用一台仪器检测以保证实验一致性。 650nm 激发光 488nm 激发光 FL1：FITC，Alexa Fluor 488，CFSE 最大激发波长 不同发射波长 FL2：PE FL3：PerCP FL7：APC 备注：网上或者流式抗体试剂公司资料都能查询到各种染料的激发光与发射光波长。 经典的FSC SSC示例图： 外周血样品 白细胞 淋巴细胞：T、B淋巴细胞 单核细胞：分化为巨噬细胞和DCs 粒细胞：中性粒、嗜酸性、嗜碱性 20-30%，直径8-10μm 6%，直径10-30μm 60-70%，直径10-15μm 备注：以后无论流式做什么图，都要事先查询多篇文献，至少3篇，看最标准正规的图是何种，上 机时电压补偿按到标准图调整。 所以，以后跑血液样品的图，如果跑出来不是这种，就说明你做的不对！ 死细胞和细胞碎片 备注：不同样品来源（血液、脾脏、肿瘤、腹腔）的流式标准图变化差异较大！ 流式散点图，一个点代表一个细胞。 肿瘤微环境 肿瘤细胞与其所处的环境内的各种细胞、细胞因子和趋化因子相互作用形成的一个促进肿瘤生长和发展的免疫抑制性环境。 本实验常利用流式细胞术来研究肿瘤微环境中各免疫细胞群的改变，这对于药物或者疫苗等等抗肿瘤效果极其作用机制的研究具有重要提示作用！ 免疫效应细胞: DC cells，NK cells， CD4+ T cells, CD8+ T cells, and M1 macrophages 免疫抑制细胞: Myeloid derived suppressor cells(MDSC，骨髓来源的抑制细胞）, M2 macrophages, and CD4+ Foxp3+ regulatory T cells（调节性T细胞） 肿瘤微环境中最常见免疫细胞群分类及指标 备注：请自己多阅读肿瘤微环境综述文献和查找不同细胞群的标准流式指标及图例！ 样图实例： 肿瘤样品 特点：细胞类型繁多，杂乱，不仅包含大小不均匀的肿瘤细胞，还包括各种免疫细胞，因此 圈门需特别注意，现在貌似魏老师要求必须染CD45的白细胞抗原标志以增加数据分析准确性。 树突状细胞DC CD11b+ CD11c+ CD80、CD86等 CD45+ CD45 ssc 树突状细胞DC CD11c CD11b λ-Carrageenan NS 骨髓来源体外刺激诱导的DC样品（BMDCs） 特点：细胞纯度较高，DC阳性比例可达60%以上 FSC SSC 圈门正确， 阳性比例高 FSC SSC 圈门错误， 阳性比例高 T淋巴细胞 CD4+ CD8+ CD69+ 激活T淋巴细胞的标志 CD45+或者CD3+ 肿瘤样品：必须加染CD45或CD3，否则很难检测出分群较好的肿瘤微环境中的T淋巴细胞 B16-F10肿瘤：软的？不用胶原酶消化 圈门错误 × 圈门正确? T淋巴细胞 CD4+ CD8+ CD69+ 激活T淋巴细胞的标志 CD45+或者CD3+ 肿瘤样品：必须加染CD45或CD3，否则很难检测出分群较好的肿瘤微环境中的T淋巴细胞 4T1或CT26肿瘤：硬的？需用I型胶原酶消化 脾脏或者淋巴结样品，比较纯，可以不染CD45和CD3。根据经验，小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞比例在20%-30%，而CD8+T淋巴细胞通常在10%左右。所以你的实验不在此比例范围内说明实验出错。 T淋巴细胞 CD4+ CD8+ CD69+ 激活T淋巴细胞的标志 CD45+或者CD3+ FSC
