如何制作鼠脑切片，并进行免疫荧光组织化学染色？

1.组织准备

1) 灌注固定：用 100 mg/kg的戊巴比妥溶液腹膜腔注射，使动物深度麻醉；同用心脏灌注的方法，将动物的心脏完全暴露，将灌注的尖针插入动物的左心室，先用约 20 ml 的生理盐水冲去体内血液，而后用含 4%（w/v）多聚甲醛的 0.1 M PB 溶液 50 ml 进行灌注固定；

2) 取材、后固定、脱水：去除颅骨后将小鼠全脑完整取出，放入上述 4%的多聚甲醛固定液中后固定，4℃后固定 6 -24h，而后将脑组织浸泡于 30%蔗糖溶液中，4℃至组织沉底（72 h左右)；

3) 包埋切片：分别将脑组织用 OCT 包埋后，用恒冷箱切片机做冠状切片，片厚为 40 μm，放入 0.01 M PBS 中，漂洗 3 次后进行后续的组织化学染色。

2. 免疫荧光组织化学染色

1) 封闭非特异性抗原：将上述漂洗后的切片用

含 1% 山羊血清0.01 M PBS 室温下孵育封闭 40min-1 h；

2) 孵育一抗：将封闭后的切片直接放入用抗体稀释液稀释的一抗混合液中，4°摇床孵育过夜；

3) 孵育二抗：孵育完一抗的切片用 0.01 M PBS 漂洗后，移入二抗混合液中；室温下孵育 2-5 小时（避光）；

4) 孵育 FITC 结合的 avidin：最后一组切片用 0.01 M PBS 漂洗后，加入用 0.01 M PBS 稀释的 FITC 结合的 avidin（1: 1, 000），室温下孵育 2 小时；如果抗体带荧光，省略该步骤。

5) 裱片、封片：步骤 3）和步骤 4）中的切片用 0.01 M PBS 漂洗后，在避光环境下裱到干净的载玻片上，晾干后用上述的含抗淬灭剂的荧光封片剂封片（如果抗体带荧光则使用普通载玻片），4℃避光保存。

6）显微镜观察。