期刊：Clinical and Translational Medicine
影响因子：10.892
发表时间：2022
样本类型：肿瘤细胞
客户单位：同济大学医学院附属上海第十人民医院
通过测量细胞死亡和脂质活性氧（ROS）的产生来确定细胞中的铁死亡水平。通过对肝癌细胞进行RNA-seq和蛋白质组检测，确定目标分子RB1CC1。后续通过免疫印迹和免疫组织化学分析RB1CC1和相关蛋白的表达。通过ChIP-seq检测肿瘤细胞中的铁死亡和RB1CC1的转录程序。最后，构建了肝癌小鼠模型，来评估JNK激动剂对一种铁死亡诱导剂(IKE)治疗的影响， 图 实验设计1、RB1CC1使肿瘤细胞对铁死亡敏感
为了筛选潜在的脂质ROS调节和铁死亡相关因子，作者对erastin（脂质ROS和铁死亡诱导剂）和Fer-1（脂质ROS和铁死亡抑制剂）处理的肝细胞癌（HCC）HepG2细胞进行了RNA-seq和蛋白质组学研究。结果获得了六个候选分子，其中沉默RB1CC1产生了最显著的效果（图1），即对铁诱导的细胞死亡变得不敏感。作者继续评估了用RSL3（铁死亡诱导剂）和erastin处理的一系列癌细胞系中RB1CC1的表达，发现在HepG2、结肠癌HCT29等多种癌细胞中RB1CC1以时间依赖性方式上调（图1C-D）。在用RSL3和erastin处理的HepG2细胞中，自噬体形成的没有显著增强（图1E）。结果表明，RB1CC1通过不依赖自噬的方式对铁死亡敏感。为了探索 RB1CC1 在体内的作用，作者在预给药IKE 2天后，通过剖宫产获得RB1CC1纯合缺失的小鼠胎儿，发现IKE介导的胎儿的丙二醛和4-HNE不如WT组强（图 1G-I），证明了铁死亡相关的脂质过氧化是RB1C1依赖性的。此外，RB1CC1敲除组的IKE并不像对照组那样抑制肿瘤生长并诱导脂质过氧化（图 1J-L）。图1 RB1CC1使肿瘤细胞对铁死亡敏感
2、核易位的RB1CC1作为铁死亡调节转录因子
为了探究RB1CC1 如何参与铁死亡的信号调节，通过RB1CC1的KO（敲除）或过表达（OV）减轻或增强RB1 mRNA表达（图2A），这表明RB1CC1可能作为转录因子，在触发铁死亡时增强靶基因的转录。随后通过ChIP实验，发现 RB1CC1 被募集到用RSL3和erastin处理细胞中的 RB1 启动子中的 RB1CC1 结合区 (RBR)（图 2B）。RB1CC1在触发铁死亡后1小时从细胞质转移到细胞核，并在HepG2细胞中在处理后4小时变得明显（图2C）。HepG2细胞的细胞分级实验进一步证明了RB1CC1的铁死亡诱导的核易位（图2D）。通过磷酸化蛋白凝胶检测，发现RB1CC1中的499-548位氨基酸区域对于铁死亡诱导的RB1CC1核易位至关重要（图 2E），S537A突变能消除了RSL3和erastin治疗后RB1CC1的超移（图 2F-H），细胞定位实验和细胞死亡检测也均表明RB1CC1在S537残基处以铁死亡依赖的方式被磷酸化（图 2I-J）。以上证明RB1CC1的铁死亡诱导的核易位与S537残基的磷酸化有关，对肿瘤细胞的铁死亡敏感至关重要。 图2 RB1CC1的核易位使细胞对铁死亡敏感3、RB1CC1涉及H4K12Ac组蛋白修饰在刺激增强子依赖性转录中的新作用
为了探索铁死亡触发后其转录活性的机制，作者进行了免疫沉淀（IP）和蛋白质组学。组蛋白H4被鉴定为RSL3-和erastin诱导的RB1C1相关蛋白质。组蛋白乙酰化与转录重编程密切相关。作者评估了RB1启动子内RBR周围的两种主要组蛋白H4修饰H4K12Ac和H4K16Ac，发现H4K12Ac水平以铁死亡和RB1C1依赖的方式升高（图3B），而H4K16Ac水平没有变化。这些结果表明，RB1CC1可能通过增加H4K12C组蛋白修饰水平参与铁死亡。在HepG2细胞中使用抗rb1cc1和抗h4k12ac抗体进行ChIP-Seq来检测肿瘤细胞中的铁死亡和RB1CC1依赖性转录程序，发现与RSL3和erastin有关的RB1CC1占据了5个新的峰，并伴随着H4K12Ac组蛋白修饰的显著增加（图 3C-E）。通过基序分析和荧光素酶报告实验，表明铁死亡诱导的增强子活性可能依赖于RB1CC1与FOX基序的相互作用（图 3F-G）。根据RNA-seq结果，RSL3处理后SEC3、CYTH3、MEPCE、CYREN、CHCHD3、TPD52、SLC25A32、MYC和VRK3表达上调，是潜在的铁死亡相关基因（图 3H）。通过3C实验确定了RB1cc1相关增强子和铁死亡相关基因启动子之间的相互作用（图 3I-J）。这些结果揭示了增强子结合对于RB1CC1刺激铁死亡相关基因的表达至关重要。 图3 RB1CC1与H4K12Ac连接，介导铁死亡相关和增强子依赖的转录4、RB1CC1 通过其靶基因调节线粒体和铁死亡
GO富集发现九个铁死亡相关基因中的三个（图3H）被预测与线粒体相关，其中两个被预测参与线粒体内膜组织（图4A）。这表明RB1CC1可能通过其靶基因CHCHD3以线粒体依赖的方式使细胞对铁死亡敏感（图 4A-C）。在缺乏线粒体DNA的细胞系中过表达CHCHD3，发现线粒体至少是RB1CC1和CHCHD3对铁死亡敏感的关键（图 4D-F）。根据MMP和细胞死亡检测，RSL3和erastin处理后，CHCHD3敲除使RB1CC1对MMP的刺激无效（图 4G-J）。小鼠模型体内实验进一步证明，IKE诱导的Chchd3表达是Rb1cc1依赖的，同时，Rb1cc1对于RSL3和erastin诱导的Chchd3的上调是不可或缺的（图 4K-M）。因此，CHCHD3作为RB1CC1的下游效应分子，决定了线粒体功能和铁死亡。 图4 RB1CC1靶基因与线粒体相关5、ELP3与RB1C1相互作用以调节H4K12C组蛋白修饰和铁死亡相关转录程序
通过蛋白组学检测寻找RB1C1相关的组蛋白调节因子，结果发现了48种RSL3诱导的H4相关蛋白和143种erastin诱导的H3相关蛋白（图 5A）。ChIP和Re-ChIP实验表明，RSL3和erastin处理后，两种与线粒体相关RB1CC1靶基因CHCHD3和SLC25A32通过ELP3诱导表达（图 5B-E）。通过3C实验和ChIP检测，在ELP3敲除细胞中，ELP3对于SLC25A32和CHCHD3这两个基因的启动子和增强子的关联是不可或缺的（图 5F-G）。这表明ELP3对RB1CC1刺激铁死亡相关的转录重编程至关重要。细胞共定位和细胞死亡实验结果表明，RB1CC1和ELP3依赖C端相互作用，对于使肿瘤细胞对铁死亡敏感至关重要（图 5H-J）。 图5 ELP3对于RB1CC1介导的铁死亡相关转录重编程至关重要
6、激活JNK刺激RB1CC1使铁死亡敏感并抑制肿瘤发生
使用FDA批准的药物库（Sel-leckchem）处理对铁死亡的敏感性低的A549细胞，确定了PTX、Cllolar、OXA和TMZ这四种可协同诱导RB1CC1核易位的药物（图 6A-D）。这四种药物均可磷酸化和激活JNK，使用JNK抑制剂可阻止JNK和RB1CC1的磷酸化，而RB1CC1的磷酸化对其核易位至关重要（图 6E-G）。这表明JNK激活物倾向于增强RB1CC1的磷酸化及其核易位。此外，结果表明JNK抑制剂可减轻RSL3和erastin诱导的MMP、mitoROS的生成和细胞死亡（图 6J）。IKE与PTX、Cllolar、OXA和TMZ共同给药可抑制甚至逆转肿瘤生长（图 6K）。 图6 激活JNK加强了RB1CC1对铁死亡的敏感性作用7、本研究的临床和转化意义
研究还表明RB1CC1在肺癌队列中也表达上调（图 7A-B）。根据RB1CC1的细胞定位，将肺癌样本分为细胞质亚型、核亚型和质/核亚型，免疫组化分析显示细胞核亚型的4-HNE水平最高（图 7C-E）。大部分检测的肺癌样本为RB1CC1核定位，核定位的原代LUSC细胞对铁死亡的敏感性也较高（图 7F-G）。作者发现DEN/ccl4在WT和RB1CC1+/-小鼠肝癌模型中诱导肝肿瘤发生的能力相似（图 7H-I）。在RB1CC1+/-小鼠中，IKE对肿瘤生长的抑制作用显著降低，生存结果也受到了影响（图 7J-K）。总之，RB1CC1对于基于铁死亡的抗肿瘤治疗的疗效至关重要。 图7 本研究的临床和转化意义本研究确定了RB1CC1是肿瘤细胞中感知铁死亡的关键调节因子，并提出了一种新的铁死亡相关调节信号通路。同时，以RB1CC1为靶点是加强基于铁死亡的肿瘤治疗的一个有希望的前景。
参考文献
Tumour cells are sensitised to ferroptosis via RB1CC1-mediated transcriptional reprogramming. Clinical and Translational Medicine, 2022.
