纳他霉素产生菌诱变、种内原生质体融合及发酵条件研究-沈阳农业大学食品学院

要

食品防腐是食品工业的重要内容，也是食品科学工作者最为关注的一个问题。食品腐败变质不仅会使食品丧失营养价值，还会造成食物中毒。目前，常用的防腐措施是添加食品防腐剂。

天然防腐剂是近年来国内外倡导、开发和寻求的新型产品，它不但对人体健康无害，有的还具有一定的营养价值，是今后开发的方向。到目前为止，国外已开发出了数十种天然食品防腐剂，建立了完备的法规。国内对天然食品防腐剂的研究起步较晚，目前尚属初级阶段，为适应社会发展要求，国内学者也做了大量的工作。

天然防腐剂具有抗菌性强、安全无毒、水溶性好、作用范围广等合成防腐剂无法比拟的特点。纳他霉素是一种天然的生物防腐剂，目前市场的需求量很大，但限制其生产的主要原因就是发酵产量太低。本文对纳他霉素产生菌的诱变育种和原生质体融合进行了较系统的研究，以期获得较为高产的纳他霉素生产菌株。实验主要通过对纳他霉素产生菌的初筛选、诱变育种、原生质体制备、融合和原生质体诱变育种以及发酵条件优化来提高纳他霉素产生菌的发酵产纳他霉素水平。

1）确立了高效液相色谱法（HPLC）测定发酵液中的纳他霉素的条件。检测波长：303nm；流动相：甲醇:水体积比为60:40，流速：1.00mL/min，保留时间为6min。线性回归方程为Y=61036X+31764，R2=0.9998。当信噪比为3时的最小检测限为0.25μg/mL。平均回收率为100.23%，平均RSD为0.753%。

2）首先对菌种适宜生长的斜面进行筛选，纳塔尔链霉菌适宜在61号和42号培养基斜面上生长；恰塔努加链霉菌适宜在61号培养基上生长。利用琼脂块法对纳塔尔链霉菌和恰塔努加链霉菌进行初筛，选择了发酵性能较好的纳塔尔链霉菌SN11号菌株和恰塔努加链霉菌SC21号菌株作为诱变出发菌株，摇瓶产量分别为0.669g/L和1.098g/L，硫酸链霉素的最小抑制浓度（MIC）分别为0.2μg/mL和10μg/mL。

3）利用电脉冲强光对纳塔尔链霉菌SN11号菌株闪照3次，硫酸二乙酯对恰塔努加链霉菌SC21号菌株诱变50min。根据纳他霉素的生物合成途径和代谢调节机理，以硫酸链霉素作为抗性筛选剂，筛选到高产菌株纳塔尔链霉菌SN114号菌株和恰塔努加链霉菌SC216号菌株，纳他霉素摇瓶产量分别为1.090g/L和1.262g/L，是原始菌株的1.6倍和1.31倍。

4）对纳塔尔链霉菌SN114号诱变株和恰塔努加链霉菌SC216号诱变株的原生质体制备和再生进行了研究，得到SN114号诱变株的最适原生质体制备和再生条件为甘氨酸添加量1.0%，菌龄44h，溶菌酶浓度4mg/mL，酶解温度35℃，酶解时间为60min；SC216号诱变株原生质体制备的最适条件为甘氨酸添加量1.2%，菌龄52h，溶菌酶浓度8mg/mL，酶解温度35℃，酶解时间60min。

5）初步对纳塔尔链霉菌SN114号诱变株和恰塔努加链霉菌SC216号诱变株的原生质体进行了紫外诱变和电脉冲强光的诱变育种研究，筛选得到纳塔尔链霉菌高产菌SN1142号菌株和恰塔努加链霉菌SC2164号菌株，其纳他霉素摇瓶发酵产量分别达到1.62g/L和1.98g/L。硫酸链霉素的最小抑制浓度（MIC）分别为0.3μg/mL和15μg/mL。

6）对纳塔尔链霉菌SN1142号菌株和恰塔努加链霉菌SC2164号菌株原生质体融合育种进行研究，采用单亲紫外灭活结合抗药性筛选的原生质体融合，筛选得到的纳他霉素高产菌Sr-1菌株，纳他霉素产量可达2.45g/L，遗传性能稳定，并对其进行了鉴定。

7）对融合子Sr-1菌株摇瓶培养基组成和发酵条件进行了优化，考察了单一碳氮源、混合碳氮源、前体物质和初始pH值对发酵生产纳他霉素的影响，利用响应面法获得了最佳的培养基配方为葡萄糖33g/L，糊精7.7g/L，胰蛋白胨26g/L，酵母浸粉8.2g/L，初始pH7.0。优化后的发酵条件为：接种量2%；装液量20mL/250mL；摇床转速220r/min；发酵温度为29℃。通过培养基和发酵条件优化后融合子的纳他霉素产量达3.17g/L。

8）以纳他霉素摇瓶发酵为基础，进行了纳他霉素发酵由摇瓶到5L发酵罐的放大，确定通气量为4L/min，搅拌转速为450r/min，发酵的溶氧界点不低于20%、发酵周期为86h和产素期pH应控制在5.5，最佳的接种量为6%，纳他霉素产量为2.92g/L。

9）利用HPD200A大孔吸附树脂对发酵液中的纳他霉素进行纯化，得到了粗结晶，纯度可达86.6%，回收率83%。