在最近发表在《细胞干细胞》Cell Stem Cell 国际期刊上的一项研究中，研究人员假设人类多能干细胞衍生的心肌细胞 (hPSC-CM) 的起搏器样活动会导致植入性心律失常 (EA)，这会阻碍细胞疗法的临床应用使用 hPSC-CM 治疗心肌梗塞 (MI)。
人的心脏没有再生潜能。因此，当一次 MI 发作后非收缩性疤痕组织取代了 10 亿成人 CM 时，这会损害心脏功能，进而甚至可能导致心脏病发作或心力衰竭。
hPSCs 的发现为 MI 治疗开辟了新途径。注意高纯度的 hPSC-CM，其心肌内移植在梗塞心脏中形成新的心肌移植物，跟随宿主的窦房结 (SA) 节点起搏。这些正在作为 MI 后人类心脏再生的候选者进行深入研究。然而，EAs 是一种短暂但持续的室性心动过速 (VT)，阻碍了基于 hPSC-CMs 的细胞疗法的临床应用。此外，与成人心室 CM (vCM) 不同，hPSC-CM 表现出自动性，即自发和有节奏地去极化和触发动作电位 (AP) 的能力。
到目前为止，研究人员已经使用亚急性 MI 的小鼠、大鼠、豚鼠和非人灵长类动物 (NHP) 模型来检查 hPSC-CM 移植的效果。在这些细胞的正常成熟过程中，自动化仍然仅限于起搏系统中的特化细胞，在小型动物模型中，高心率通常会掩盖 EA。然而，在心率与人类相当的大型动物模型中，即每分钟 70 次 [bpm]，hPSC-CM 的移植会在一周内触发 EA，这可能是由移植物-宿主电耦合引起的。
EA 触发的 VT 通常持续一个月（平均），使猪和 NHP 的心率高达每分钟 300 转 (rpm)，在某些严重的情况下，这对猪来说可能是致命的。然而，在大多数情况下，EA 会随着移植物的成熟而逐渐减弱。由于人类可能无法容忍快速 EA，因此确定在移植物成熟之前控制 EA 的策略至关重要。
NHP 和猪的侵入性电生理学研究还表明，移植物产生的自发异常冲动（因为 hPSC-CM 由于膜电位去极化程度更高而表现出更短的 AP 持续时间）导致 EA 而不是传导缺陷（即再进入通路） . 它似乎与相关离子通道的胎儿样基因表达谱有关。因此，超速起搏和直流电 (DC) 复律不能终止 EA。
关于研究
作者之前曾表明，移植到大鼠梗塞心脏中的 hPSC CM 成熟后会表现出成人样肌原纤维同种型组织。该模型非常模拟 hPSC-CM 在人体内经历的成熟环境，因此具有更多的临床和生理相关性。在这个模型中，他们进行了激光捕获显微切割 (LCM)，然后进行了批量核糖核酸测序 (RNA-seq)，以表征 hPSC-CM 在体内成熟过程中的全基因组表达动力学，这需要大约 12 周的时间。
为了从大鼠心脏中提取体内移植的 hiPSC-CM，他们在移植前用绿色荧光钙调蛋白 (GCaMP3) 对它们进行了转导。为了进行比较，他们分析了在体外长期培养长达一年的 hiPSC-CM。他们还分别分析了人类特异性和大鼠特异性的 RNA-seq 读数（或移植物信号）。
然后，研究人员着手生成 hPSC-CM，它与成人 vCM 一样自动化程度较低，但具有适当的电生理行为，即响应电刺激而跳动。为此，他们使用 CRISPR/Cas9 技术并系统地敲除过度表达的离子通道基因——单独和组合。
研究人员在体外对这些 hPSC-CM 进行了表征，并在体内模型中测试了基因编辑对 EA 的影响，即移植了 1.5 亿个 hESC-CM 的免疫抑制尤卡塔小型猪未受伤的心脏。他们使用连续心电图 (ECG) 系统监测他们的心率和节律，这表明他们的 EA 负担。此外，他们确定了 hPSC-CM 移植后所有离子通道基因的表达动力学，以整理 EA 介质列表，并将它们的电生理学设计成类似成人的表型。
此外，研究人员着手了解通过用小分子调节 WNT 信号通路分化的人胚胎干细胞衍生心肌细胞 (hESC-CM) 的自动化驱动因素。为了评估特定离子流的作用，研究人员根据可用的转录组学和药理学数据，对可能在 hESC-CM 自动化中发挥重要作用的离子通道候选基因进行基因操作，这有助于他们确定使无效化所需的最少基因编辑数量自动化（或 EA）。
结果
单一、双重和三重基因编辑降低了心跳率并破坏了 SA 节点节律，但它们无法分别在体外和体内消除自动化或 EA 。四个基因 HCN4、CACNA1H 和 SLC8A1 的四重编辑或同时敲除 (KO)，加上称为 MEDUSA 的 KCNJ2 的过表达，消除了 hESC-CM 在体外（>10 个细胞系）的自动性，而不影响这些细胞的能力在受到刺激时发射 AP，即细胞处于静止状态但可兴奋。
相对于野生型 (WT) 对照和其他细胞系，四重基因编辑后 CM 的移植不会导致体内持续的 EA 。此外，美杜莎 hESC-CMs 移植物稳定三个月，与宿主心肌同步跳动，并表现出明显减弱的 VT。这些修改还防止了猪在 hPSC-CM 移植后的发病率、死亡率和心力衰竭。
与体外培养相比，基因表达谱在体内显示出更强更快的成熟，后者在培养一年后滞后。在 hPSC-CM 中诱导更像成人的离子通道基因表达谱会降低自动化程度，并可能降低移植后 EA 的负担。有趣的是，研究结果强调了 Ca 2+运输在 hESC-CM 自动化中的重要性。
结论
需要进一步的研究来测试 MEDUSA hESC-CM 是否可以在移植到梗死大鼠心脏后有效地工作。这是必要的，因为研究人员观察到 MEDUSA 细胞并非完全静止。在热休克或其他应激条件下，它们偶尔会自发跳动。
同样，移植引起的应激，如局部缺血或炎症，可以在体内诱导类似的跳动活动，这可能控制在高剂量美杜莎细胞移植过程中观察到的自我限制性 EA 发作。然而，这项研究表明，与 WT 对应物相比，美杜莎 hESC-CM 具有良好的特征。此外，将致心律失常性较低的 hESC-CM 与伊伐布雷定相结合可能会在临床试验期间带来额外的安全益处。
总之，这些结果为 hESC-CM 的自动化背后的机制提供了新的见解。然而，需要做更多的工作来确定 MEDUSA hESC-CM 是否可以潜在地恢复收缩功能，这是安全地使受伤的心脏再血管化所需的进步。
期刊参考：Gene editing to prevent ventricular arrhythmias associated with cardiomyocyte cell therapy, Silvia Marchiano, Kenta Nakamura, Hans Reinecke, Lauren Neidig, Michael Lai, Shin Kadota, Filippo Perbellini, Xiulan Yang, Jordan M. Klaiman, Leslie P. Blakely, Elaheh Karbassi, Paul A. Fields, Aidan M. Fenix, Kevin M. Beussman, Anu Jayabalu, Faith A. Kalucki, Jennifer C. Potter, Akiko Futakuchi-Tsuchida, Gerhard J. Weber, Sarah Dupras, Hiroshi Tsuchida, Lil Pabon, Lili Wang, Björn C. Knollmann, Steven Kattman, R. Scott Thies, Nathan Sniadecki, W. Robb MacLellan, Alessandro Bertero, Charles E. Murry, Cell Stem Cell 2023
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