今天给大家介绍一款好玩的技术应用。虽然技术不是特别新鲜，但是应用到生物钟网络中，仍然让在下惊叹甚为巧妙！这篇文章是英国分子生物学实验室医学研究委员会的Michael Hasting教授课题组于2018年11月新发表在PNAS上。
——生物钟网络简介——
先简单介绍下生物钟的背景知识。我们知道很多行为表型的产生都是受内在的分子网络调控的，对于我们人体的生物钟节律来讲，亦是如此。我们之所以会有较为正常的睡眠清醒周期循环，都是受生物钟这个分子网络的精细调控。生物钟的核心分子网络是一个由四个元件构成的转录翻译负反馈循环。转录因子CLOCK和BMAL激活下游负调控元件Cry和Per基因的转录，二者在细胞质中翻译完成后入核抑制转录因子的活性，从而抑制自身基因的转录，形成负反馈，如图1。随着CRY和PER蛋白的降解，二者对转录因子的抑制作用被解除，则开启下一个循环。从而形成了这样一个循环往复的振荡过程。宏观上的表现为，在此振荡行为调控下，我们很多体征也表现为振荡现象，比如前文提到的睡眠清醒周期循环过程中涉及到的褪黑素水平的振荡现象。夜晚褪黑素水平升高，告诉我们，我们累了需要休息了，白天褪黑素水平降低，告诉我们该从睡梦中清醒开始工作了。再比如我们的代谢过程、免疫能力等等都会有这样一个24h的振荡变化。
图1 生物钟核心分子网络 [2]
上述的整个分子网络存在于几乎所有类型的细胞中，而生物钟网络和古代的帝王制度一样，等级极为分明。所有的外周组织的生物钟节律都受到大脑一个叫做SCN区域的调控。今天介绍的这篇文章主要着眼于核心调控者SCN组织的节律调控，通过可逆性地编辑小鼠SCN区域的节律元件，实现小鼠全身的节律行为的可逆性调节。
——CRY蛋白的翻译开关设计——
前文介绍的生物钟网络中的核心元件CRY的双敲会导致小鼠全身性的节律紊乱。本文便选取这样的模式小鼠，在此基础上设计一个翻译开关，进行CRY蛋白翻译的可逆性调节，从而实现小鼠生物钟节律有无的可逆性调节。核心设计原理是利用正交的aminoacyl-tRNA synthetase/tRNACUA对，通过腺病毒感染的方式引入SCN组织中。腺病毒感染的载体在表达CRY1蛋白时，在异位终止密码子处引入非天然的氨基酸，使得只有提供此非天然氨基酸的情况下，此阅读框才能完整转录，当此非天然氨基酸缺失时，则转录过程会在此异位终止密码子处停止，CRY1蛋白则不能够完成表达过程。
图2 腺病毒转染质粒结构
作者主要构建了两个载体，一个是在hU6启动子后面插入了正交的pyrrolysyl-tRNAcua（PylT）和pyrrolysyl-tRNA合成酶PylRS（PylS）基因，后面带了一个mCherry报告基因（见图2上），通过mCherry的信号强弱来表征腺病毒载体编码合成酶/tRNA对的活性强弱。另外一个载体，腺病毒Cry1-Cry1（177TAG）::EGFP，编码感兴趣的CRY1蛋白，C端带了一个EGFP的标签蛋白来使蛋白表达过程可视化。Cry1可以通过Cry1启动子启动转录，但在异位终止密码子TAG处有特定氨基酸依赖性。腺病毒载体将pyrrolysyl-tRNA合成酶（PylRS）的底物--非天然氨基酸炔赖氨酸（ncAA alkyne lysine,简称AlkK）引入Cry1表达过程中，使得Cry1翻译过程呈现AlkK依赖性，只有AlkK存在时，Cry1才能完成翻译，否在在异位终止密码子处则会终止表达。这也就对生物钟网络中CRY1蛋白的表达与否实现了可逆性调节，从而使细胞或者小鼠生物钟节律的有无也实现了可逆性调节（见图3），为研究生物钟网络提供了一个非常方便快捷的方法，同时这个方法也可以广泛应用到其他神经生物学或者细胞生物学的领域中。
图3 Cry1表达开关控制生物钟节律
可以明显的看到在没有非天然氨基酸AlkK时，细胞看不到振荡现场，加1mM AlkK后，振荡现象极为明显，将AlkK洗掉后，则振荡现象又消失不见。
总之，Hasting教授的此工作为研究生物钟网络提供了一个非常方便快捷的方法，同时这个方法也可以广泛应用到其他神经生物学或者细胞生物学的领域中。
参考文献：
[1] Maywood, Elizabeth S., et al."Translational switching of Cry1 protein expression confers reversiblecontrol of circadian behavior in arrhythmic Cry-deficient mice."Proceedings of the National Academy of Sciences (2018): 201811438. https://doi.org/10.1073/pnas.1811438115
[2] https://events.umich.edu/event/33581
作者：小鱼儿
编辑：蔡臣静
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