——正文——
冬凌草甲素(Oridonin)是一种来自于中药冬凌草(Rabdosia rubescens)的对映-贝壳杉烷二萜化合物(图1a)。冬凌草以及冬凌草甲素具有显著的抗炎效果。据药典记载，冬凌草的功效为清热解毒，活血止痛，被广泛的用于炎症治疗。而冬凌草甲素可以控制NF-κB和MAPK的激活，进而抑制促炎因子的释放。然而，冬凌草甲素的抗炎靶点并不清楚。
2018年6月29日，来自中国科学技术大学的Rongbin Zhou研究组，Wei Jiang研究组和Xianming Deng研究组在Nature Communications在线发表题为"Oridonin is a covalent NLRP3 inhibitor with strong anti-inflammasome activity"的研究论文，报道了冬凌草甲素抗炎的分子机理(He et al.)。
NLRP3炎症小体（Inflammasome）是一个多蛋白复合物，包括先天免疫感受器NLRP3，ASC和caspase-1。炎症小体的组装会导致caspase-1的激活，进而促进pro-IL-1β和pro-IL-18的水解，生成有功能的IL-1β和IL-18。由于NLRP3在先天免疫和炎症中扮演着关键角色，作者推测抗炎的冬凌草甲素可能会影响NLRP3的功能，并通过实验进行证明。
作者首先测试冬凌草甲素是否可以影响caspase-1的激活以及IL-1β的分泌，结果发现在人类外周血单核细胞中，LPS诱导的caspase-1激活以及IL-1β分泌可以被冬凌草甲素所抑制，且对不依赖于炎症小体的TNF-α的生成不受影响(图1b)。另外，作者还发现冬凌草甲素可以剂量依赖性的抑制caspase-1的激活、IL-1β的分泌以及细胞凋亡，但是对于不依赖于炎症小体的TNF-α生成没有影响(图1c)。因此，作者认为，冬凌草甲素是一个NLRP3炎症小体专一性抑制剂。
图1. 冬凌草的分子结构以及对IL-1β分泌的影响
接下来，作者研究了冬凌草甲素抑制炎症小体的分子作用机理。在NLRP3的组装中，一个关键的步骤是NEK7和NLRP3的相互作用，这对于随后的NLRP3寡聚化以及招募ASC至关重要。作者发现，冬凌草甲素可以同时抑制NEK7-NLRP3和NLRP3-ASC的相互作用。作者进而确定了，在HEK-293T细胞中，冬凌草甲素也可以抑制NLRP3-NEK7的结合。同样的抑制效果也出现在纯化的NLRP3和NEK7蛋白上。与之相反，冬凌草甲素并不能抑制NLRP3-NLRP3的相互作用。此外，在HEK-293T细胞中，冬凌草甲素也不能抑制NLRP3-ASC的相互作用。因此，作者认为，冬凌草甲素抑制效果都是来自于直接破坏NLRP3-NEK7的相互作用。
接下来，作者研究了冬凌草甲素是结合在NLRP3还是NEK7上。作者用生物素（Biotin）标记的冬凌草甲素与细胞裂解液进行pull down实验，结果发现只有NLRP3蛋白可以被富集下来，且可以被没有标记的冬凌草甲素竞争掉。作者还使用MST测定了冬凌草甲素与NLRP3之间的结合力，结果发现KD值约为52.5nM(图2)。以上证据表明，冬凌草甲素可以直接结合在NLRP3上。
作者还发现，冬凌草甲素与NLRP3的结合是不可逆的共价结合。为此，作者构建了9个突变体，依次将NLRP3中的9个半胱氨酸突变为丙氨酸，发现只有C279A会破坏冬凌草甲素与NLRP3的结合。因此，冬凌草甲素是结合于NLRP3的C279上。
冬凌草甲素中含有一个α,β-不饱和酮，可以作为一个迈克尔加成反应受体与C279的硫醇发生反应。为了确认这一点，作者合成了一个还原态的冬凌草甲素，对其中的碳碳双键进行了加氢还原。还原态的冬凌草甲素不能与NLRP3结合(图3b)，也不能抑制NLRP3炎症小体的激活，进一步说明冬凌草甲素与NLRP3的共价结合。
图 3. (a)还原态冬凌草甲素的结构；(b)还原态冬凌草甲素pull down实验结果；(c, d)还原态冬凌草甲素western blot实验结果。
——小结——
冬凌草作为传统中药，其功用主治为清热解毒，活血止痛。在本文中，作者使用大量的实验证明了冬凌草甲素与NLRP3的共价相互作用以及对NLRP3功能的影响。这一研究揭示了冬凌草抗炎效果的分子机理，为更好的利用和开发冬凌草以及冬凌草甲素奠定了基础。
作者： 梁 浩
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