开发自闭症谱系障碍新模型小鼠 -通过蛋白质组学分析对分子病情理解和治疗方法开发的期待-

2024年3月26日 理化研究所 顺天堂大学 东京大学 开发自闭症谱系障碍新模型小鼠 -通过蛋白质组学分析对分子病情理解和治疗方法开发的期待- 理化学研究所(理研)脑神经科学研究中心分子精神病理研究小组的中村匠研究员(研究开始时:东京大学研究生院综合文化研究科广域科学专业博士课程)、髙田笃组长、顺天堂大学研究生院医学研究科精神行为科学的加藤忠史主任教授、 东京大学研究生院综合文化研究科广域科学专业生命环境科学系的坪井贵司教授等共同研究小组建立了自闭症谱系障碍( ASD )的有力相关基因[1]KMT2C的变异小鼠，该变异小鼠表现出与ASD患者相似的行为变化，明确了与ASD相关的遗传基因群的表达变化在大脑中发生，这样的行为变化和遗传基因表达变化的一部分通过给药会恢复。
本研究成果有望在加深对ASD病情理解的同时，有助于治疗方法的开发。 此次，联合研究小组着眼于有力的ASD相关基因、促进组蛋白甲基化[2]的KMT2C基因，利用CRISPR/Cas9系统[3]建立了缺失KMT2C基因的基因修饰小鼠。 Kmt2c变异小鼠表现出社会性和柔软性降低等ASD样行为，显示出作为ASD模型小鼠妥当的行为变化。 另外，通过着眼于基因表达的组学分析(转录子分析[4] )，在变异小鼠的大脑中，发现了已知的ASD风险基因的表达发生变化，这些可能对ASD的病情产生了贡献。 此外，研究人员还发现，通过施用被预测为可消除因KMT2C缺失导致的组蛋白甲基化变化的组蛋白去甲基化酶LSD1抑制剂，KMT2C变异小鼠的社会性降低和基因表达变化得以恢复。 本研究刊登在科学杂志《Molecular Psychiatry》在线版( 3月26日:日本时间3月26日)上。

Kmt2c基因缺失小鼠表现出的ASD样行为通过给药得到改善 背景 自闭症谱系障碍( ASD:Autism Spectrum Disorder )是一群以社会交流问题和有限的行为兴趣为主要症状的发育障碍。 最近在美国的流行病学调查报告，8岁的孩子有2.8%左右会被诊断为ASD。注1 )。 已知ASD是与遗传因素密切相关的疾病，近年来最大规模的遗传学分析在统计学上有意义[5]地报告了与ASD相关的有力的ASD相关基因。 这些ASD相关基因组中含有大量与染色质[6]修饰相关的表观遗传学因子[7]，可能这样的分子功能与ASD病情相关。 具有染色质修饰功能的有力的ASD相关基因之一是kmt2c ( lysine methyl transferase 2c )基因，提示其杂合缺失[8]与ASD相关。 KMT2C基因编码将甲基加成到染色质修饰之一的组蛋白H3的第四个赖氨酸( H3K4)上的酶。 据报道，参与这种H3K4甲基化[2]的基因组与其他神经发育障碍和精神分裂症等精神神经疾病相关。 因此，我们发现H3K4甲基化相关基因的功能变化与各种精神神经疾病的病情相关，在认知功能和大脑的发育中也起着很大的作用。 然而，迄今为止，KMT2C基因杂合缺失导致ASD的病理机制尚未明确。 注1 )美国疾病预防控制中心“在key findings from the addm network|autism|NCB DDD|CDC新选项卡中打开”

研究方法和成果 联合研究小组通过基因编辑技术CRISPR/Cas9系统，建立了KMT2C杂合变异小鼠，再现了在ASD患者中明显出现的KMT2C杂合缺失。 首先，为了评价该变异小鼠作为ASD模型小鼠是否妥当，进行了多个一般行为测试，观察了Kmt2c变异小鼠的行为变化。 结果，Kmt2c变异小鼠在评价小鼠社会性的三室社会性试验[9]中表现出了显著的结果。 在该试验中，野生型小鼠通常在未知小鼠所在的笼子附近停留的时间明显长于在空笼子附近停留的时间，表现出提示小鼠社会性的行为(图1A )。 但是，Kmt2c变异小鼠没有表现出那样的停留时间偏差，显示了社会性低下的结果(图1B )。 此外，使用知识分子[10]评价鼠标的柔软性时，发现了显著的行为变化。 在这个行为试验中，只允许老鼠喝四个角的饮料瓶中的一个，每天在对角线上有规律地移动那个可以喝水的角，评价老鼠对这种状况变化的应对方法(图1C上)。 Kmt2c变异小鼠在改变饮水角点往返对角线之日，即改变移动规则之日，在前一天可饮水的角点停留时间明显长于野生型小鼠(图1C下)。 该结果可能表示Kmt2c变异小鼠对环境突然变化的灵活性降低。 社会性和灵活性下降是ASD患者的特征表现型。 建立的Kmt2c变异小鼠，满足了作为ASD研究模型小鼠的合理性，认为以该小鼠为对象的病情研究是有效的。

图1 Kmt2c变异小鼠行为变化 A:野生型小鼠三腔社会性试验结果。 野生型老鼠在未知老鼠所在的笼子附近有意地长时间停留，对未知老鼠表现出兴趣。 B:Kmt2c变异小鼠三腔社会性试验结果。 Kmt2c变异小鼠在空笼子和未知小鼠笼子附近的停留时间没有差异，表明对未知小鼠不表现出兴趣。 C:知识分子笼评价柔软性的试验结果。 在Kmt2c变异小鼠中，在规则变更日，访问前一天能饮水的角落的比例显著变大。 因此，联合研究小组的目标是阐明被预测为与Kmt2c变异小鼠表现出的ASD样行为有关的分子机制。 由于已知KMT2C蛋白质控制的H3K4的甲基化与信使RNA(mRNA )的转录活性有关，假设KMT2C变异小鼠中也发生了基因转录控制的广泛变化，并假设出生后11周的成体小鼠 结果，在Kmt2c变异小鼠的大脑中，鉴定了统计学上表达明显上升或下降的基因组(图2 )。 关于已鉴定的表达变动基因组，调查了其与已知的ASD遗传风险的重叠情况，发现在变异小鼠中表达明显上升的基因组，与有力的ASD相关基因，有超过偶然的概率重叠(图2 )。 此外，根据ASD的基因组宽相关分析( GWAS ) [11]数据推测的与ASD风险相关的基因组区域、ASD患者死后大脑中的表达变动基因组等也明显聚集在Kmt2c变异小鼠中表达上升的基因组中 而且，与ASD相关的突触功能相关的基因组等也果然表达上升了。 这种很可能与ASD相关的已知遗传风险的表达上升，显示出有可能对KMT2C杂合缺失导致的ASD的病情做出了贡献。

图2 Kmt2c变异小鼠成体脑中的转录子变化 在Kmt2c变异小鼠的大脑中，各种基因有意义地表达变动(红色或蓝色的点)，特别是在表达上升的基因组中，ASD相关基因(框线所示的基因)的含有概率比偶然高。 联合研究小组接着分析了出生后4天龄小鼠大脑中的转录本变化，认为ASD是一种在幼年时期，即发育初期就能出现症状的神经发育障碍。 为了获取更高分辨率的基因表达信息，联合研究组进行了由理研开发的转录分析方法，Quartz-Seq2进行的单细胞RNA测序(单胞RNA-seq )注2 )，发现了各细胞簇中的 针对识别出的各团簇的表达变动基因组，求出了成体小鼠的RNA-seq分析中所进行的ASD遗传风险的集成度、表达变动基因的观测数与期望值之间的偏离度，并在此基础上进行了识别出的细胞团簇的排序 结果表明，放射状神经胶质[12]和未成熟的神经细胞等排名较高，在神经系统分化较初期的细胞群中，表达变动基因数显著增加和ASD风险聚集(图3 )。 本结果提示，Kmt2c杂合缺失的影响来自神经系统分化的早期阶段，这种发生早期阶段的影响可能与病情有关。

图3新生儿脑单胞RNA-seq分析可能参与病情的细胞簇 A:出生后4天龄小鼠脑样本中鉴定的细胞簇图谱。 各编号与b的细胞簇名的编号相对应。 b :鉴定的细胞簇排序。 对Kmt2c变异小鼠中各细胞簇的表达变动基因组进行了表达变动基因的数量、与ASD相关基因的重复、GWAS数据引起的ASD风险SNP的聚集、与ASD患者死后脑中的表达变动基因的重复四个尺度的分析 神经系统分化的初期细胞群一贯表现出较高的排名。该结果提示，Kmt2c杂合缺失的影响可能来自大脑发育的早期阶段。 另一方面，在Kmt2c变异小鼠中没有观察到特定种类的细胞明显增减的观察结果。 最后，联合研究小组为了探索治疗干预的可能性，研究了Kmt2c变异小鼠的ASD样行为通过给药实验是否能得到改善。 在本实验中，向KMT2C变异小鼠给予了组蛋白去甲基化酶LSD1的抑制剂，该抑制剂有望消除具有赋予组蛋白甲基功能的KMT2C缺失带来的影响。 将具有LSD1抑制效果的药剂之一的vafidemstat ( bifidemstat )，对Kmt2c变异小鼠饮水给药4周，进行了各种各样的行为试验，在变异小鼠中看到的社会性降低，在给药的变异小鼠中得到了恢复。 为了揭示已鉴定疗效的分子机制，我们采用从野生型小鼠、未给药的Kmt2c变异小鼠、给药的Kmt2c变异小鼠三组中提取的脑样品，再次进行了基于RNA-seq的转录分析。 于是，在未给药的Kmt2c变异小鼠中，明显表达变动的427个基因中，88.3%的377个基因通过给药发生了反向表达变动，这一点得到了明确。 也就是说，在Kmt2c变异小鼠中表达上升的基因因给药而表达下降，在Kmt2c变异小鼠中表达下降的基因因药剂而表达上升。 由此可知，本研究着眼的LSD1抑制剂Vafidemstat对Kmt2c变异小鼠的部分ASD样行为及转录本变化具有改善效果。

图4 LSD1抑制剂对Kmt2c变异小鼠行为转录变化的恢复 A:未用药的Kmt2c变异小鼠三腔社会性试验结果。 果然再现了空笼子和未知老鼠笼子附近的停留时间没有差别，对未知老鼠不表示兴趣。 B :给药Kmt2c变异小鼠三室社会性试验结果。 在有未知老鼠的笼子附近明显地长时间停留，对未知老鼠表现出了兴趣。 C :在未给药的Kmt2c变异小鼠的大脑中，表达发生了明显变动的共计427个(表达降低基因217+表达上升基因210 )中，88.3%的377个基因的表达根据药剂的效果发生了反向变动。 注2 ) 2018年3月13日新闻发布会《从数千个1细胞中准确测量RNA含量和种类》 今后的期待 期待这次的研究能为ASD的病情理解以及治疗方法的开发做出巨大的贡献。 另外，KMT2C参与的H3K4甲基化对大脑功能和发育很重要，KMT2C变异小鼠也可以应用于以理解这些为目标的基础研究。 关于对Kmt2c变异小鼠显示治疗效果的LSD1抑制剂，考虑到报告了对同样控制H3K4甲基化的精神分裂症相关基因Setd1a的变异小鼠和组蛋白修饰显示变化的其他ASD模型小鼠的行为变化的治疗效果，认为 另外，本次研究中使用的Vafidemstat正在进行第ⅱ相临床试验，注3 )，还需要进一步验证，但期待今后在ASD及其他精神神经疾病的病情阐明和治疗方法开发方面取得进展。 注3 ) S. Hofmann et al .，EUR.phys.j.a 48，62 ( 2012 )。 补充说明 1 .自闭症谱系障碍( ASD )的有力相关基因 2022年由Jack M.Fu等人报告的基因。 着眼于ASD患者中稀有的基因变异，在由20，627名ASD患者群和42，610名对照组的基因组成的大规模遗传学分析中，被报告为超过了非常严格的显著性水平的基因。 详情请参考英语原著论文(在10.1038/s41588-022-01104-0新标签中打开)。 2 .组蛋白甲基化，H3K4甲基化 组蛋白由H1、H2A、H2B、H3、H4种组成，担负着缠绕DNA使其在核内高密度地封装的作用。 组蛋白n末端的赖氨酸残基或精氨酸残基的甲基化被认为与基因表达控制和染色质的高级结构的形成有关。 组蛋白H3K4的甲基化是一种表观遗传修饰，发生在组蛋白H3的第4个赖氨酸( H3K4)上的甲基修饰。 被赋予了甲基的H3K4作为mRNA转录活跃的区域的标记为人所知。 3.CRISPR/Cas9系统 基因组编辑技术之一。 由含有识别目标基因组区域序列的导向RNA和DNA切割酶的Cas9蛋白构成，可以切割基因组中的任意区域。 细胞修复基因组时，会发生基因组缺失、插入，破坏任意基因功能。 4 .转录本分析 是指对在组织和细胞中表达的转录产物( RNA )的全面分析。 通过新一代测序仪全面获取RNA序列片段信息，进行基因表达量的定量。 5 .统计学意义 在统计分析中，针对观察到的影响，评价其可靠性，在偶然发生的概率低的情况下统计上有意义。 6 .染色质 组蛋白(见补充说明[2] ) 8聚体周围缠绕的结构称为核小体，真核生物中以核小体为基本单位的基因组DNA和蛋白质的高级复合体称为染色质。 7 .表观遗传因子 不依赖于DNA碱基序列的基因调节机制称为表观遗传学，与其调控相关的因素称为表观遗传因子。 8 .杂合缺失 指人类、小鼠等多种有性生殖生物所具有的两组同源基因组中，有一组基因缺失。 9 .三室社会性别试验 使用被划分为可以自由往来的三个房间，观察老鼠行为的试验。 可以调查老鼠的社会性等。 10 .知识分子笼

一种鼠标用行为试验装置，可以在集体环境下半自动地评价鼠标的行为、记忆学习行为、空间认知功能。 设置了饮料瓶和控制饮用水的门的实验室设置在笼子的各个角落，设定的行动课题成功后门就会打开，可以喝水。 11 .基因组宽相关分析( GWAS ) 基因组中的数十万到数百万的SNP (是在基因组序列中发现的个人间的单核苷酸差异中，在集团内以1%以上的频率被发现的基因多态性之一。 SNP是全面调查single nucleotide polymorphism的缩写)，鉴定与有无疾病、身高、体重等性状相关的基因组区域的研究方法。 GWAS是genome-wide association study的缩写。 12 .放射状神经胶质 作为神经干细胞，具有分化为神经、星形胶质细胞、少突胶质细胞等脑内主要细胞种类的功能。联合研究组 理化研究所 脑神经科学研究中心 分子精神病理研究小组 队长髙田笃( takatadatoshi ) 研究员中村匠 (研究开始时:东京大学研究生院综合文化研究科广域科学专业博士课程) 技术人员ⅰ本多久乐乐

技术人员ⅰ上田顺子

客座研究员原伯德 精神病动态研究小组(研究当时) 副队队长(研究当时)笠原和起(高崎) 研究员(研究当时)中岛一夫 技术人员ⅰ(研究当时)石渡瑞穗

行为遗传学技术开发小组(研究当时) 团队领导(研究当时)丝原重美( itoharageyoshi ) 研究员(研究当时)小林祐树 精神生物学研究小组(研究当时) 团队领导(研究当时)内匠透

基础科学特别研究员(研究当时)仲西萌绘 生命功能科学研究中心 分子序列比较分析小组(研究当时) 团队领导(研究当时)工乐树洋

技术人员ⅱ(研究当时)种子岛千春

技师(研究当时)门田满隆 顺天堂大学研究生院医学研究科精神行为科学 主任教授加藤忠史 东京大学研究生院综合文化研究科广域科学专业生命环境科学系 教授坪井贵司 京都大学研究生院医学研究科附属动物实验设施 教授浅野雅秀

特定讲师(研究当时)吉原亨 研究支援 本研究由日本医疗研究开发机构( AMED )创新技术解明脑功能网络全貌的项目“通过脑基因组信息分析进行精神疾病相关神经回路的鉴定和功能解明(研究代表者:岩本和也)”、同脑的研究推进程序“以丘脑室旁核为起点的精神疾病的病态解明( ) 同脑科研战略推进计划“三重样本序列分析识别一组由基因型定义的双相障碍(研究代表:髙田笃)”、 该基因组医疗实现推进平台事业(前沿基因组研究开发: GRIFIN )“基于寡基因模型的人类疾病遗传结构的分析(研究代表者:髙田笃)”、该战略性国际脑科学研究推进计划“体细胞变异对双相障碍的意义的阐明和神经基因组病理学 日本学术振兴会( JSPS )科学研究费资助事业新学术领域研究(研究领域提案型)“基于双相障碍·精神分裂症的变性建模的构成性理解(研究代表者:加藤忠史)”，同学术变革领域研究( b )“聚类/ 决定中枢细胞的基因关键分子途径的确定及其与人类疾病的关联分析(研究代表:髙田笃)”，同基础研究( b )“通过双相障碍大规模序列分析进行的罕见生殖细胞序列变异和体细胞变异的综合研究(研究代表:髙田笃)”， 在该特别研究员奖励费“使用基因改变小鼠进行的双相障碍患者倭黑猩猩变异的功能分析(特别研究员:中村匠)”、该年轻人研究“着眼于具有表观控制功能的甲基转移酶的自闭症病情阐明(研究代表者:中村匠)”的资助下进行。 原论文信息 Takumi Nakamura、Toru Yoshihara、Chiharu Tanegashima、Mitsutaka Kadota、Yuki Kobayashi、Kurara Honda、Mizuho Ishiwata、Junko Ueda Moe Nakanishi、Toru Takumi、Shigeyoshi Itohara、Shigehiro Kuraku、Masahide Asano、Takaoki Kasahara、Kazuo Nakajima、Takashi tsusu Atsushi Takata* & Tadafumi Kato*(*责任作者)、 " transcript omic dys regulation and autistic-like behaviors in kmt2c haploinsufficient mice rescued by an ls D1 inhibitor "，molecular psych 主讲人 理化研究所 脑神经科学研究中心分子精神病理研究小组 队长髙田笃( takatadatoshi ) 研究员中村匠 (研究开始时:东京大学研究生院综合文化研究科广域科学专业博士课程) 顺天堂大学研究生院医学研究科精神行为科学 主任教授加藤忠史 东京大学研究生院综合文化研究科广域科学专业生命环境科学系 教授坪井贵司 中村匠研究员的照片 中村匠 髙田笃队长的照片 髙田笃 加藤忠史主任教授照片 加藤忠史 新闻发言人 理化研究所宣传室新闻发言人 将在新选项卡中打开咨询表单