大家好，今天给大家解读一篇题为 Single-cell lands cape of primary central nervous system diffuse large B-cell lymp homa (原发性中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤的单细胞景观) 原发性中枢神经系统弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 (PCNS DLBCL) 是一种罕见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤，在组织学上占非 HIV 相关原发性中枢神经系统淋巴瘤的大多数 (90%)。
01
研究背景
了解肿瘤免疫微环境 （TIME） 中的肿瘤异质性和免疫浸润对于免疫疗法的创新至关重要。在这里，结合单细胞转录组学和染色质可及性测序，我们分析了原发性中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤（PCNS DLBCL）患者中恶性细胞的肿瘤内异质性和TIME的免疫特性。我们展示了与肿瘤促进途径、细胞周期和 B 细胞免疫反应相关的多种恶性程序。通过整合来自独立全身性 DLBCL 和滤泡性淋巴瘤队列的数据，我们揭示了一种与 PCNS DLBCL 独特相关的 RNA 剪接活性异常升高的促生存计划。此外，在 PCNS/活化的 B 细胞 DLBCL 中复发的浆母细胞样程序预示着更差的预后。此外，PCNS DLBCL 中克隆扩增的 CD8 T 细胞经历了从衰竭前样状态到衰竭的转变，并且表现出比全身性 DLBCL 更高的衰竭特征评分。因此，我们的研究揭示了PCNS DLBCL患者预后不良的潜在原因，这将促进靶向治疗的发展。
见图一
使用 scRNA-seq 与 V（D）J 分析和 scATAC-seq 配对对 PCNS DLBCL TIME 进行表征。
图一
a 肿瘤切片处理和scRNA-seq与V（D）J分析和scATAC-seq配对的工作流程示意图。
b 根据 scV（D）J 数据，按 scRNA-seq 的细胞簇（左）和免疫受体分类（右）着色的所有细胞的 UMAP。虚线圆圈突出显示了主要的细胞类型。NK自然杀伤细胞、寡突胶质细胞、gd Tγ-δ T细胞、Treg调节性T细胞、CD8 Tex耗竭的CD8 T细胞、CD8 Tprolif增殖性CD8 T细胞、CD8 Tmem样记忆样CD8 T细胞。
c scRNA-seq数据中所选标记基因的归一化表达水平着色的所有细胞的UMAP。颜色条表示单个细胞中每个基因的对数归一化表达值。
d 由scATAC-seq的细胞簇着色的所有细胞的UMAP。虚线圆圈突出显示了主要的细胞类型。
e 根据 scATAC-seq 数据中所选标记基因的基因活性评分着色的所有细胞的 UMAP。彩条表示单细胞中每个基因的基因活性评分，这是通过将与基因体区域相交的片段和转录起始位点上游 2 kb 相加计算得出的。
f 甜甜圈图显示了每个患者恶性 B 细胞的 B 细胞状态分类（外圈）和 COO 分类（内圈）。箭头表示从 S1 到 S5 的 B 细胞状态代表从更像 GCB 到更像 ABC 的亚型的恶性肿瘤。在（c）和（e）中，标记基因包括T细胞的CD3D，CD8 T细胞的CD8A，B细胞的MS4A1，骨髓细胞的CD163和少突胶质细胞的MOG。
见图二
PCNS DLBCL患者肿瘤内恶性元程序的鉴定。
图二
a 热图描绘了源自 PCNS DLBCL 患者的肿瘤内程序的成对相关性。行和列都表示由共识 NMF 算法以样本方式识别的程序。左侧的彩条指示每个程序所属的样本。每个模块的颜色表示两个程序之间的皮尔逊相关系数 （PCC）。进一步的分层聚类在样本中鉴定了七个连贯的表达元程序 （MP1–7）。每个元程序的代表性基因显示在热图的右侧。
b 在七个元程序中显著富集的代表性生物通路的热图。按数据集 （c）、癌症类型 （d）、样本 （e） 和 COO 分类 （f） 着色的恶性细胞的 UMAP。FL滤泡性淋巴瘤、tFL转化性滤泡性淋巴瘤、DLBCL弥漫性大B细胞淋巴瘤。
g 箱线图显示了每位患者中元程序富集的细胞比例。箱线图中的每个点代表个体患者的细胞比例，并将患者分为不同的癌症类型。采用双侧Wilcoxon秩和统计量计算显著性（***P < 0.001，**P < 0.01，*P < 0.05）。方框边界和中线分别对应于四分位距 （IQR） 和中位数。晶须延伸到距框边界不超过 IQR 的 1.5 倍的最低或最高数据点。
在（c）中，Steen等人。14， Zhang et al.27和 Roider 等人。13代表三个公开可用的scRNA-seq数据集;“pcnsl”代表本研究中的PCNS DLBCL数据集。
见图三
存在具有肿瘤促进特征的 PCNS DLBCL 特异性表型。
图三
a 来自代表性样本（P201）的单个细胞（行）的CNV图谱热图，这是根据每个染色体位置（列）周围的基因的平均表达推断的。红色：染色体扩增;蓝色：染色体缺失。
b 基于inferCNV结果的样本P201单细胞克隆树。根据计算出的包含相应CNV的亚克隆中细胞的百分比对分支进行缩放。
c P201恶性细胞的UMAP，由（b）中克隆树的节点着色。虚线圆圈突出显示节点 I 中的单元格（包括叶节点：K、L、O、P）。
D 由 MP1 特征评分着色的 P201 恶性细胞的 UMAP（左）;小提琴图显示了克隆树节点中细胞的 MP1 签名分数（右）。虚线圆圈突出显示具有高 MP1 签名分数的单元格。e 堆积条形图，显示克隆树节点细胞中剪接和未剪接基因计数的比例。
f 维恩图显示了仅使用未剪接和剪接基因计数与其他节点相比的节点 I 的 DEG。显示具有代表性的 DEG。来自P201的恶性细胞的UMAP，由基因SRSF10（g）和BCL2（h）的剪接基因计数（左）和未剪接基因计数（右）着色。
见图四
PCNS DLBCL中的浆母细胞样表达程序。
图四
a B细胞scATAC-seq和scRNA-seq数据联合分析的工作流程示意图。我们首先将参考数据集（King等人）的PCA嵌入和聚类注释映射到我们的scRNA-seq数据。然后，通过典型相关性分析将聚类注释从scRNA-seq数据转移到scATAC-seq数据中。
b 由从公开参考数据转移的 GC B 细胞簇注释着色的 B 细胞的 UMAP。虚线圆圈突出显示浆母细胞。
c 按 MP2 签名分数着色的 B 单元格的 UMAP。虚线圆圈突出显示 MP2 单元格。
d 显示 B 细胞中选定功能基因表达水平的热图。
e 条形图显示了在浆母细胞样恶性细胞中显着富集的 TF。标有星号的TF是浆母细胞分化的主要TF。
f 带状图显示了恶性 B 细胞中 RNA 表达水平（上图）和相应的 TF 基序活性（下图），带有 GC 簇注释。
g 20例PCNS DLBCL患者的无复发生存期（RFS）曲线和229例全身性DLBCL患者的无进展生存期（PFS）曲线（基于MP2特征评分）。P 值通过对数秩检验计算。
见图五
TIME 中耗竭的克隆扩增 CD8 T 细胞和旁观者 CD8 T 细胞的表征。
图五
a scRNA-seq数据中由CD8 T簇（a）和TCR克隆（b）的克隆扩增着色的CD8 T细胞的UMAP。CD8 Tprolif增殖性CD8 T细胞，CD8 Tex耗竭的CD8 T细胞（包括耗竭的CD8 T-1-6），CD8 Tmem样记忆样CD8 T细胞。
c 量化每位患者每对 CD8 T 簇之间的 TCR 重叠（Morisita 指数）。每个点代表一个患者。P 值通过双侧 Wilcoxon 秩和检验计算。
d CD8 T细胞簇的选定T细胞功能标志物的热图。
e CD8 T 细胞的 UMAP，按基因 ENTPD1 （CD39） 的表达水平着色。
f 基因组追踪图显示了scATAC-seq数据中ENTPD1（CD39）的聚集基因组峰。
g 箱线图显示了不同 B 细胞淋巴瘤类别中 CD8 T 细胞的耗竭评分。进行 Kruskal-Wallis 检验，然后对 Fisher 最小显着性差 （LSD） 进行事后检验以评估显着性。紧凑的字母显示用于显示成对比较的显着性，其中任何两组不共享任何字母的疲惫得分显着差异。反应性淋巴液 反应性淋巴结炎。
h 肿瘤反应性 CD8 T 细胞的 UMAP，按 scRNA-seq 数据的轨迹分析确定的耗竭阶段着色。
i 与 （h） 相同，但使用 scATAC-seq 数据。
j 箱线图显示了不同耗竭阶段肿瘤反应性CD8 T细胞的耗竭评分。
k 与 （j） 相同，但使用 scATAC-seq 数据。在（j），（k）中，P值通过双侧Wilcoxon秩和检验计算。
l 热图显示不同衰竭阶段肿瘤反应性CD8 T细胞中TCF7和PDCD1的表达水平。
m 与 （l） 相同，但使用 scATAC-seq 数据。热图显示基因表达 （n） 和基序活性 （o） 沿伪时间轨迹的动态。在 （g）、（j） 和 （k） 中，箱体边界和中线分别对应于 IQR 和中位数。晶须延伸到距框边界不超过 IQR 的 1.5 倍的最低或最高数据点。
02
研究结论
此外，我们应用计算策略来整合scRNA-seq数据和scATAC-seq数据，这仍然是该领域的分析挑战。能够分析同一单个细胞内染色质可及性和转录组的尖端方法可用于精确剖析驱动表达程序的潜在机制。尽管如此，我们对 PCNS DLBCL 的高通量和多组学分析以及对独立队列的后续分析促进了对 PCNS DLBCL 的肿瘤内异质性和 TIME 复杂性的理解，这可能有助于促进这种恶性肿瘤靶向治疗的发展。
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