本文来源：类器官学社
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神经发育障碍是一类常见的神经系统疾病，其中自闭症谱系障碍是最为典型的一种。近年来，随着单细胞技术和CRISPR技术的发展，科学家们开始探索使用单细胞脑类器官培养和CRISPR技术相结合的方法，研究与自闭症谱系障碍相关的基因突变对细胞命运决定的影响。
今天小学社要分享的就是一项《Nature》上发表的最新研究，该研究通过这种方法，成功地鉴定了与自闭症谱系障碍相关的高风险基因，并揭示了这些基因对细胞命运决定的影响。这项研究为在具有细胞状态、分子通路和基因调控网络读数的类器官模型中进行疾病易感基因的高通量表型表征铺平了道路。
人类大脑皮层发育涉及独特的过程，这些过程由精确和高度协调的遗传和分子程序控制，其中许多程序仍然难以捉摸。许多神经发育障碍(NDD)，如自闭症谱系障碍(ASD)，只有在出生后，大脑发育几乎完成时才被诊断出来，在人类背景下分析与ASD相关的发育和细胞类型特异性缺陷至关重要。脑类器官为研究这些障碍提供了人类背景，但其表型变异性和低通量限制了其实用性。
本研究旨在通过使用CRISPR-人脑类器官-单细胞RNA测序（CHOOSE）系统，在脑类器官中筛选高风险ASD基因，以克服这些限制。
使用CHOOSE系统对人类脑类器官中的ASD风险基因进行多重筛选。
在胚胎体中诱导eCas9，然后进行神经诱导。
使用荧光激活细胞分选（FACS）分析突变细胞。
在类器官中鉴定多种细胞类型，包括祖细胞、兴奋性神经元、抑制性神经元、星形胶质细胞和少突胶质前体细胞(OPC)。
RNA速度分析揭示从神经前体细胞到神经元群体的发育轨迹。
构建脑类器官的发育基因调控网络，鉴定与ASD相关的调控模块
1. 条形码类器官的单细胞CRISPR筛选与选择类器官产生多种细胞类型
研究人员使用表达增强特异性SpCas9 (eCas9)的人胚胎干细胞(hES)系进行CRISPR干扰的类器官系统的构建。该系统通过慢病毒载体传递4-羟他莫昔芬诱导的CRE重组酶和双单导RNA (sgRNA)盒，使用基于流式细胞术的gRNA报告基因检测来确定每个sgRNA对的编辑效率，并使用克隆条形码监测创始细胞的克隆复杂性。该系统具有高效、可控、克隆复杂度高的特点。
此外，研究人员还选取了与ASD风险相关的36个基因进行研究，通过基于荧光激活细胞分选(FACS)的分析，发现受扰动的细胞状态类似于未受扰动细胞状态，同时成功鉴定了多种端脑细胞类型，揭示了从神经祖细胞到背侧和腹侧端脑神经元群的发育轨迹，还发现了一组表达MEIS2和高水平PAX6的中间神经元，并对筛选的几个ASD基因的细胞类型特异性表达模式进行了进一步分析（图1）。
图1
2. 细胞增殖耗竭表型与干扰ASD基因的细胞类型特异性效应
研究人员从scRNA-seq互补DNA文库中恢复了gRNA信息，并从四个类器官池中提取了大量基因组DNA。研究发现，ecas9诱导的细胞中存在异质gRNA的表达，通过比较ecas9诱导细胞和未诱导细胞，发现gRNA存在显著富集和缺失，并证实了四个基因(KMT2C, LEO1, ADNP和WAC)在个体扰动类器官中的富集和消耗表现出最大的效应量。此外，研究发现在ASD患者和脑类器官疾病模型中出现细胞类型特异性改变，对多个ASD基因扰动进行系统评估、比较和分类，并发现在24次扰动中，背侧与腹侧细胞比例发生了显著变化，大多数干扰导致背腹比降低，其中KMT2C的扰动导致腹侧细胞的富集。对于23个扰动，至少一种细胞类型丰度发生变化，此外，六种扰动只针对一种细胞类型。在祖细胞中发现中间祖细胞（IPC）损耗在扰动中具有强烈的收敛效应，在多种扰动中IPC和中间神经元前体细胞（INP）受影响最严重。通过分析特定的神经元亚群，发现L2/3兴奋性神经元在多数扰动中受到更大的影响和消耗。这些数据表明ASD病理可能早在神经祖细胞阶段就存在（图2）。
图2
3. ASD基因扰动后基因表达的改变以及ASD相关的监管模块
研究人员在所有扰动中检测到2071个差异表达基因(DEG)，还在背侧和腹侧种群中识别出基因失调，以及在一个种群中特异性失调的基因(KMT2C, LEO1扰动)。此外，许多基因在多重扰动中存在差异表达。基因本体术语富集分析表明，细胞粘附、细胞分化、前脑发育和细胞外生是最相关的生物学过程，并发现了许多特定于微扰的基因本体术语。这些结果说明使用CHOOSE系统可以检测复杂生物表型。
此外，研究人员使用多组学数据来构建基因调控网络（GRN）模型，以确定与ASD相关的调控枢纽，并观察到在背侧和腹侧端脑中存在特定的转录因子模块，这些模块受到ASD遗传扰动的影响。在研究过程中，研究人员使用了Pando等算法来推断出这些基因的调控网络，并检验了SFARI基因库中的基因对这些调控网络的富集度。研究结果表明，OLIG1和EOMES等关键因素以及与ASD相关的调控因子存在高度相关性（图3）。
图3
4. ARID1B干扰对v-RGCs的影响
研究人员发现，ARID1B的扰动导致了腹侧放射状胶质细胞（v-RGC）的显著富集。此外，ARID1B干扰的细胞在OPC轨迹中强烈富集，使v-RGC向早期OPC的转变概率明显高于向神经元命运的转变概率。
为了证实这些发现是否与人类疾病相关，研究人员招募了两名携带ARID1B杂合突变的患者进行验证。实验结果表明，与正常对照组相比，这两名患者相应的神经节隆起(GE)体积增大，其OLIG2+细胞比例也呈显著上升，这些表明ARID1B的缺陷导致了腹侧祖细胞扩增异常和细胞命运异常（图4）。
图4
本研究使用了单细胞脑类器官培养和CRISPR技术相结合的方法，研究了与自闭症谱系障碍相关的基因突变对细胞命运决定的影响。研究团队发现，神经元前体细胞和星形胶质细胞是最容易受到基因突变影响的细胞类型。通过构建脑类器官的发育基因调控网络，研究团队为我们深入了解神经发育障碍提供了新的思路和方法。这项研究为未来开发更有效的治疗自闭症谱系障碍的方法提供了重要的理论基础。
参考文献
Li C, Fleck JS, Martins-Costa C, Burkard TR, Themann J, Stuempflen M, Peer AM, Vertesy Á, Littleboy JB, Esk C, Elling U, Kasprian G, Corsini NS, Treutlein B, Knoblich JA. Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism. Nature. 2023 Sep;621(7978):373-380. doi: 10.1038/s41586-023-06473-y. Epub 2023 Sep 13. PMID: 37704762; PMCID: PMC10499611.
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