长期以来，肺癌在全球范围内稳居癌症高发种类之列，且成为癌症相关死亡的主要原因。根据组织学分类，大约87%的肺癌为非小细胞肺癌（NSCLC）。手术是早期NSCLC患者的首选方案。然而，许多NSCLC患者在已无法接受手术的阶段被确诊，或术后病情复发。尽管免疫治疗领域小有突破，但其疗效仍不尽如人意。因此，在现有的NSCLC治疗方法之外，探寻新的抗肿瘤成分对于提高患者生存率具有重要意义。知母，具备清热解毒、滋阴润燥、止咳平喘等多种药用功效。知母皂苷AIII是一种甾体皂苷，具有抗癌、抗神经退行性、抗炎等药理活性。在肝癌和乳腺癌的治疗中，被认为是最具潜力的活性成分。然而，关于其在肺癌中的作用及潜在的分子机制，目前尚无明确认识。一篇名为“Timosaponin AIII promotes non-small-cell lung cancer ferroptosis through targeting and facilitating HSP90 mediated GPX4 ubiquitination and degradation”的研究在探讨了Tim-AIII在NSCLC细胞中的作用，及其在体内外的作用机制。
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Tim AIII抑制NSCLC细胞增殖、诱导死亡并导致G2/M周期停滞
为了评估Tim-AIII对NSCLC细胞的细胞毒性和抑制作用，研究者对H1299、A549、SPC-A1和LLC细胞进行了不同浓度和时间的Tim-AIII处理。首先，采用CCK-8检测法分析了细胞活力。结果表明，Tim-AIII对NSCLC细胞的生长抑制作用具有剂量和时间依赖性，4μM Tim-AIII处理48小时后，90%的NSCLC细胞死亡（图2A）。浓度高达4 μM时，Tim-AIII几乎不影响HBE细胞的细胞活力（90%的细胞存活）。当进一步分析受损或死亡细胞释放的乳酸脱氢酶（LDH）水平时，研究者观察到Tim-AIII以剂量和时间依赖性的方式诱导了LDH的释放，这种现象在NSCLC细胞系中尤为明显（图2B）。接下来，研究者通过集落形成实验来评估Tim-AIII处理后的细胞增殖。结果表明，Tim-AIII呈剂量依赖性地抑制了H1299和A549细胞的集落形成。在使用4 μM Tim-AIII时，几乎没有发现菌落（图2C-D）。为了进一步证实Tim-AIII对细胞增殖的影响，研究者在Tim-AIII处理后，采用流式细胞术检测细胞周期。实验结果显示，Tim-AIII促进G2/M期阻滞，且呈剂量依赖性（图2E-F）。综上所述：Tim-AIII通过启动G2/M期阻滞，有效降低细胞增殖和活力，甚至导致NSCLC细胞死亡。
图2 Tim-AIII可抑制NSCLC细胞的增殖，诱导死亡，并导致G2/M周期阻滞
Tim-AIII通过抑制上皮-间充质转化来抑制NSCLC细胞的迁移
为探究Tim-AIII对NSCLC细胞迁移的影响，研究采用了创面愈合实验。结果表明，与对照组相比，较低剂量的Tim-AIII（0.5 μM）显著抑制了H1299和A549细胞的迁移（图3A）。为进一步验证其对侵袭性细胞迁移的抑制作用，研究者进行了transwell实验。如图3B-C所示，经Tim-AIII处理24小时后，0.5 μM和1 μM Tim-AIII均显著抑制了H1299和A549细胞的迁移，而对照组未见明显影响。此外，上皮-间充质转化（EMT）在癌症进展、转移和耐药性方面具有重要作用。在给药48小时后，NSCLC细胞中几种标记物的蛋白和mRNA表达水平。结果显示，Tim-AIII抑制了间充质标记基因VIM、SNAIL-2、SNAIL-1、MMP9的表达水平，并提升了上皮标记基因E-钙粘蛋白的表达水平（图3D，E）。与mRNA表达结果一致，研究还发现波形蛋白、snail-1、蜗牛-2、n-钙粘蛋白的蛋白水平显著负调控，而上皮标记物E-钙粘蛋白呈正调控，说明Tim-AIII抑制了NSCLC细胞的EMT（图3F）。综上所述，Tim-AIII主要通过抑制EMT来抑制NSCLC细胞的迁移。图3 Tim-AIII抑制NSCLC细胞的迁移
Tim-AIII在体内抑制肿瘤进展
研究还采用了两种肿瘤模型来评估Tim-AIII在体内的治疗潜力，即皮下异种移植肿瘤模型与肺转移肿瘤模型。首先，C57BL/6J小鼠接受皮下注射LLC细胞，注射7天后，随机分为三个实验组：对照组（CT）、低剂量Tim-AIII组（12.5 mg/kg）和高剂量Tim-AIII组（50mg/kg）（图4A）。结果显示，与对照组相比，Tim-AIII治疗显著抑制肿瘤生长，这一效果在肿瘤体积和肿瘤重量方面得以体现（图4-D）。但小鼠体重无显著差异（图4E）。其次，BALB/c-nu/nu裸鼠接受皮下注射H1299细胞，注射10天后，随机分为三个实验组：对照组（CT）、低剂量Tim-AIII组（12.5 mg/kg）和高剂量Tim-AIII组（50mg/kg）（图4F）。实验表明，Tim-AIII治疗能显著抑制肿瘤生长，且呈剂量依赖性（图4G，H）。随后，研究者应用肺转移肿瘤模型。将LLC细胞静脉注射给C57BL/6J小鼠，随机分为三个实验组，分别给予Tim-AIII或PBS26天：对照组（CT）、低剂量Tim-AIII治疗组（12.5 mg/kg）和高剂量Tim-AIII组（50mg/kg）（图4I）。结果同样表明，与对照组相比，Tim-AIII治疗能显著抑制肺肿瘤生长（图4J，K）。流式细胞术检测结果显示，高剂量Tim-AIII治疗后，肿瘤微环境中Treg细胞百分比下降了2-3倍（图4L，M），这表明Tim-AIII治疗改变了肿瘤微环境中AIII介导的免疫抑制条件。皮下移植瘤中HSP90和GPX4的蛋白水平检测证实，不同剂量的Tim-AIII处理后，HSP90表达显著升高，GPX4表达显著降低（图4N）。图4 Tim-AIII在体内抑制肿瘤进展
Tim-AIII诱导的铁死亡依赖于HSP90
为进一步验证，研究者在NSCLC细胞系H1299和A549中通过转染HSP90-shRNA构建了HSP90敲除模型。在图5A-B中，代表性图像表明，转染HSP90-shRNA的H1299和A549细胞中HSP90的表达明显低于转染对照shRNA。在敲除HSP90后，Tim-AIII对H1299和A549细胞增殖的抑制作用显著减弱（图5C）。Tim-AIII诱导H1299细胞释放LDH，敲除HSP90后，A549细胞明显减少（图5D）。当HSP90被敲除，Tim-AIII导致H1299和A549细胞的铁积累、MDA产生和GSH消耗均显著消除，通过HSP90-shRNA转染实现（图5E-G）。此外，在HSP90-shRNA敲除HSP90的情况下，Tim-AIII介导的GPX4泛素化和降解过程得以取消（图5H）。图5 Tim-AIII诱导的铁死亡依赖于HSP90
总之，在小鼠模型中，Tim-AIII表现出高效、低毒性和高选择性，证实其具有潜在的NSCLC治疗化合物特性。然而，关于Tim-AIII在临床试验中的治疗效果，尚需进一步探讨。Zhou C, Yu T, Zhu R, Lu J, Ouyang X, Zhang Z, Chen Q, Li J, Cui J, Jiang F, Jin KY, Sarapultsev A, Li F, Zhang G, Luo S, Hu D. Timosaponin AIII promotes non-small-cell lung cancer ferroptosis through targeting and facilitating HSP90 mediated GPX4 ubiquitination and degradation. Int J Biol Sci. 2023 Feb 27;19(5):1471-1489. doi: 10.7150/ijbs.77979.
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