第六章 磷酸盐在植物与微生物的有益相互作用中的关键作用
6.1 持久互动的技巧和诀窍
丛枝菌根（AM）共生可以提供植物所需的大部分磷酸盐。这要归功于真菌的物理和生化特性：一方面，丛枝菌根真菌菌丝体比植物根系更能探索土壤壁龛，比磷酸盐耗竭区延伸得更远；另一方面，有研究表明，丛枝菌根真菌还能通过利用酸性磷酸酶获取土壤中的有机磷。无论如何，众所周知，调幅真菌既能寄生内共生菌，也能寄生由真菌渗出物形成的保守的芽脑相关细菌群落，因此我们很容易推测它们可能在调解或增强磷酸盐矿化方面发挥作用。
真菌具有多种磷酸盐转运体，可从根外菌丝体吸收土壤中的磷酸盐，并以多磷酸盐的形式转运至根内菌丝体。在这里，聚磷酸盐颗粒被裂解，产生大量的负电荷，这些负电荷被同时吸收的 K +、Ca 2+、Mg 2+ 和 Na + 抵消。一旦磷酸盐到达真菌的假根，它就会被释放到假根周围的膜空间中，这种机制尚待发现。
有趣的是，真菌磷酸盐转运体在根外和根内菌丝中都有表达，这表明它们可能在磷酸盐的再吸收中发挥作用。由水蒸发蛋白介导的水流或水蒸发蛋白的间接作用可能是磷酸盐沿真菌菌丝运输的关键机制之一：事实上，敲除一种根瘤蚜水甘油蛋白会阻碍多磷酸盐的转运，最近的实验证据表明，由丛枝菌根真菌（AMF）转运的水分占寄主植物转运水分的 34.6%（Rhizophagus intraradices 与Avena barbata 之间的相互作用）。
如果说基因工具的缺乏减缓了我们对从真菌方面驱动菌根磷酸盐流的分子机制的理解，那么植物磷酸盐吸收机制的关键组成部分已经得到了很好的描述。失去形成丛枝菌根共生能力的植物也失去了一个磷酸盐转运体的拷贝，而该转运体对从根周空间吸收磷酸盐至关重要。对不同植物物种进行的多项分子和生理学研究充分支持了这一遗传学证据，证明丛枝菌根特异性 PHT1 磷酸盐转运体是功能性假茎的必要条件。磷酸盐转运体不仅介导底物的转运，而且还直接或间接地调节假根的正确形成和分枝。因此，PHT1 磷酸盐转运体被认为是一种受体，与 PHO1 酵母蛋白的情况类似。作为受体，蛋白质与底物的唯一结合就能触发细胞质中的信号级联。水稻中的 OsPT13 也有类似的作用：事实上，该蛋白并不介导任何磷酸盐转移，但与野生型相比，ospt13 显示出更多退化的假茎。在日本莲（Lotus japonicus）中，丛枝菌根特异性磷酸盐转运体会根据外部磷酸盐浓度在根尖显示少量转录本积累，并可能调节根系结构. 有趣的是，磷酸盐感应与铵等其他养分感应交织在一起，外部养分的可用性在确定哪种元素是调节节肢生命周期的驱动力方面起着关键作用。这可以解释为李比希最小法则的一个侧面：当氮是限制性生长因子时，Medicago pt4 植物显示出功能性和完全发育的假根。总之，这些数据表明，当地的磷酸盐水平对丛枝菌根共生的发育和功能有很大影响，但这只是磷酸盐在这种关系中发挥作用的一个方面。
此外，磷酸盐在植物系统水平的信号事件中对共生也有众所周知的强烈影响：较高的外部磷酸盐水平会以剂量依赖的方式抑制丛枝菌根的定殖。分根实验证明这种抑制是系统性的，在分根实验中，只有二分之一的根系暴露在高 Pi 浓度下，但整个根系的丛枝菌根定殖都会受到影响。在过去几十年中，对不同的无机磷-饥饿信号进行了研究，结果表明磷酸盐水平与 miR399 或绞股蓝内酯水平之间存在很强的相关性。然而，单独来看，高磷酸盐对丛枝菌根定殖的系统性抑制作用并不明显：在不同的菌根植物系统中，无论是 miR399 的过表达还是合成芪内酯的应用都没有明显的效果。
对 PHR1 的研究提供了更多有趣的线索：该蛋白是 MYB 转录因子家族的成员，也是植物对低磷酸盐转录反应的主调节因子之一（Rubio 等人，2001 年）。它的序列和作用模式在不同植物物种中是保守的，PHR1 控制着大多数对磷酸盐饥饿有反应的基因的表达。令人惊讶的是，PHR1 的转录水平不受磷酸盐水平的调节，但其活性却受 SPX 蛋白的调节，当细胞磷酸盐浓度较高时，SPX 蛋白会将其封存。最近，研究表明 PHR 蛋白和 SPX 蛋白在调节控制丛枝菌根共生的转录级联中起着关键作用，证实了植物磷酸盐平衡在介导丛枝菌根方面的关键作用。目前仍不清楚介导植物磷酸盐感应的第一种代谢变化是什么。肌醇焦磷酸盐是缓冲细胞对磷酸盐反应的关键分子。PP-InsPs 是一系列信号分子，其特点是在肌醇六碳环周围组合排列磷酸基团。磷酸盐浓度较高的植物细胞会积累较高水平的肌醇焦磷酸盐，这些肌醇焦磷酸盐可选择性地介导 SPX 蛋白与 PHR 的结合，阻止 Pi-starvation 反应（PSR）基因的转录。一致的是，尽管∏浓度很高，但无法合成 PP-InsPs 前体的突变体表现出组成型 PSR。考虑到植物对磷酸盐和丛枝菌根真菌反应的自然变异程度，了解在高磷酸盐水平下调节菌根抑制作用的第一个代谢变化可能会为未来的农业应用铺平道路。
6.2 没有人能口哨出交响乐：整合基于原核生物的解决方案以应对营养挑战
真菌并不是在胁迫条件下提供植物抗逆能力的孤立实体；相反，它们与细菌和古细菌相互作用，构成了一个整体生物系统，应考虑其完整性。在土壤中，细菌通过参与生物地球化学循环提供多种生态系统服务，如调节养分供应、分解有机物、降解污染物以及重要无机分子的周转。此外，它们还与包括植物和真菌在内的常住生物建立了相互影响的关系，既支持它们的生长发育和营养，又提供了抵御病原体的第一道防线。由于微生物在保护土壤结构和质量方面的特殊作用，它们已被视为评估土壤健康的指标之一。从这个角度来看，欧盟在其 2022 年土壤协议中将土壤生物多样性列为监测土壤健康的指标之一。
虽然原核生物在土壤中的分布并不均匀，但可将其视为两个不同的群体：土壤主体群落和根圈群落。主体部分是土壤中不受植物根系影响的部分。该群落中的常驻细菌是由扩散和进化现象形成的，而其丰度则受生态漂移和选择事件的影响。即使环境因素和地理差异是决定土壤微生物群组成的主要驱动力，微生物之间的拮抗和有益相互作用也会改变其结构。根据 Trivedi 等人（2020 年）的研究，块状土壤可以被称为微生物的 '种子库'，是具有不同功能的细菌和古细菌的混合物，是根瘤菌群落的集合库。
另一方面，根圈是土壤中靠近根部的部分，直接受到植物代谢、生化和呼吸活动的影响。鉴于根瘤菌群寄生着无数微生物，并参与土壤与植物根系之间的相互作用，因此根瘤菌群被认为是地球上最具活力的界面之一。即使土壤特性和环境因素仍是这一土层中细菌群落组合的主要驱动力，植物也以物种依赖的方式发挥着重要的选择作用，其次是基因型依赖的方式。选择大块土壤中的细菌成为根瘤菌圈一部分的主要植物压力是根瘤渗出，即植物根器分泌多种化合物（如糖、有机酸离子、有机碳分子和氮）。事实上，这些物质在根部附近的积累与有机营养细菌的积累有关，特别是那些属于变形菌属的细菌--其中很大一部分已知参与了根源碳基质的利用。尽管根状茎渗出液存在一般模式，但其数量和组成会受到多种因素的影响，在时间和空间上以及根据作用于植物的不同生物和非生物胁迫而变化。反过来，受胁迫植物根部渗出物的改变又能为某些有利的功能特性选择大量土壤细菌，重塑根圈群落的组成，最终提高植物的适应性。这一机制的基础模型被称为 '求救信号 '假说，因为在胁迫条件下分泌活动的这种变化可被视为植物的求救信号或其请求后援的努力。
6.3 磷酸盐缺乏
磷酸盐缺乏症是限制植物生长和发育的主要条件之一，它是求助模式的一个实际例子。尽管土壤中含有大量磷，但只有一小部分（不到总量的 20%）是植物可以利用的矿物磷酸盐，其余的都是不可利用的有机磷酸盐。多项研究表明，植物如何通过在不同生长阶段释放不同类型和数量的渗出物来应对缺磷问题，从而调节根瘤菌圈中微生物群的组合（。已证明会影响土壤微生物群的化合物性质多种多样，或与植物激素代谢有关，或与养分循环有关。例如，在磷饥饿条件下，γ-氨基丁酸、含 C 化合物（苹果酸盐和柠檬酸盐）和绞股蓝内酯含量增加。对水稻进行的一项研究表明，链格内酯参与了根瘤菌群落的形成。特别是，与野生型植物相比，缺乏绞股蓝内酯生物合成基因 DWARF 17（d17）和受体 DWARF 14（d14）的水稻突变体在根瘤菌圈中积累有益细菌菌株的能力都受到了影响。另一种对根瘤微生物有重要影响的化合物是柠檬酸盐：柠檬酸盐的渗出与 LHA1 PM H + -ATPase 基因表达的增加以及随之而来的 H + -ATPase 蛋白的表达有关，后者参与质子挤出，因此参与根瘤土壤的酸化。反过来，有证据表明，根系组织中柠檬酸盐的积累是柠檬酸盐分解代谢下调的结果。另一个例子是香豆素莨菪亭，它在缺磷和缺铁的条件下通过 MYB72 和β-葡萄糖苷酶 BGLU42 的活性释放出来。这种代谢物具有抗菌活性，有利于植物选择有益微生物。最后，植物渗出物会刺激编码运动性和粘附性的细菌基因的表达，从而影响植物内部空间的定殖。
6.4 根瘤菌的作用
农业中解决土壤磷酸盐缺乏问题的主要策略是使用磷肥。然而，据观察，田间施用的大部分磷酸盐在消耗之前就已流失，造成田间微生物生物多样性丧失和水体富营养化等严重问题。鉴于一些土壤微生物具有溶解和矿化有机不溶性磷的能力，基于细菌的解决方案已被指出可能成为更可持续粮食生产技术的生态友好候选方案。能够将有机磷转化为植物可利用形式的细菌被称为磷细菌（PSB）。它们属于植物生长促进根瘤菌（PGPR）的一个大类，已知可通过产生植物刺激素和植物生长调节剂（如吲哚乙酸（IAA）、赤霉素、细胞分裂素和乙烯）来促进植物生长。在磷酸盐溶解菌中，芽孢杆菌属（Bacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas）是磷酸盐溶解菌中据报道种类最多的属。不过，该分类还包括其他菌属，如伯克霍尔德菌属、根瘤菌属、氮胞杆菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、库氏菌属、Paenibacillus 菌属、Ralstonia 菌属、Rhodococcus 菌属、Serratia 菌属、Bradyrhizobium 菌属、沙门氏菌属、Sinomonas 菌属和 Thiobacillus 菌属。PSB 通过不同的机制溶解磷酸盐。第一种机制依赖于产生低分子量有机酸，如葡萄糖酸、乙酸、甲酸、乳酸、乙醇酸、苹果酸和柠檬酸。这些酸可将环境 pH 值从 7.0 降至 2.0，有利于将 PO 4 3 转化为植物可利用的形式，即HPO4 2 和H2PO4 -。在有机酸中，PSB 主要产生葡萄糖酸，这要归功于一种膜结合酶--葡萄糖脱氢酶的存在，它能氧化葡萄糖。一项旨在了解哪种植物释放的碳源对溶解 P 活性影响最大的研究显著发现，在液体培养基中向 PSB 提供葡萄糖时，P 矿化效率最高。除了这种能力外，PSB 还能通过螯合作用促进磷酸盐溶解。一些有机酸，如 2-酮基葡萄糖酸、腐殖酸和富勒酸能够通过其羟基和羧基螯合磷表面的阳离子，并将其转化为可溶性分子。其他影响较小的机制包括产生能与含 P 分子发生反应的无机酸，促进其矿化，以及挤出 NH4 + 同化过程中产生的 H + 离子。此外，与植物相反，一些 PSB 能产生所谓的磷酸水解酶或植酸酶，这是一类参与植酸（肌醇磷酸盐）矿化的酶，是土壤中最常见的不可利用磷酸盐形式之一。磷酸酶可以是质膜周围酶，也可以是外膜结合酶，在磷酸缺乏时参与 Pi 分子的裂解，而在标准 Pi 浓度下，磷酸酶的作用受到抑制。根瘤菌与植物之间的这种相互交流是双方相互依赖关系的基础。一方面，植物通过分泌特定的渗出物来选择它们需要的细菌，以应对特定的挑战；另一方面，细菌利用这些化学物质来产生能量和生物量。总之，植物与磷细菌相互作用的基本机制可以更好地作为生物肥料加以利用，以改善植物对磷的吸收。
6.5 甜蜜的家Pi- 介导的细菌在宿主体内的栖息
与根瘤菌群落一样，内生细菌也能以依赖于宿主基因型的方式定植于内生层。内生细菌是指生活在植物内部器官而不会对其造成任何伤害的微生物。它们的作用是提供磷等养分，因此植物会专门招募它们。如上所述，根状茎沉积是植物在土壤中选择特定类型微生物的关键过程。近十年来，许多研究开始阐明宿主感知磷酸盐水平的能力与下游植物渗出活性之间的分子联系。
众所周知，植物拥有一种适应性 PSR 机制来应对周围环境中的磷酸盐缺乏问题。关于这一点，磷酸盐响应（PHR）蛋白在调节磷酸盐状态改变所诱导的转录组和代谢变化中的作用已被阐明。磷酸盐反应蛋白已被证明能与位于几个磷酸盐饥饿诱导（PSI）基因启动子上游的特定区域 P1BS 基序结合。
新的证据表明，PSR 在植物渗出物特征的改变中发挥了作用，而植物渗出物特征的改变又最终导致根瘤菌群落的重新排列。在研究最广泛的植物渗出物中，有一类香豆素是从苯丙氨酯途径中提取的。最近的研究表明，根据不同的铁元素水平，PHR1 参与了 Pi-deficiency 诱导的香豆素生物合成变化。例如，在低 Pi/ 高 Fe 培养基上生长的 phr1 突变体显示出香豆素前体的积累，这表明在野生型植物中，PHR1 在 Pi 缺乏条件下香豆素生物合成的下调过程中发挥作用。
因此，由于上述机制，细菌被招募到根瘤层中，并在此基础上被选择寄居在植物内部组织中（图 6.1）。一些研究强调了 PHRs 蛋白参与了 Pi- 依赖性根内生菌的容纳，表明磷酸盐平衡与植物免疫系统在调节这种微调方面的联系。最近的一项研究表明，拟南芥 PSR 突变体在磷酸盐贫乏的土壤中，在定殖了合成细菌群落（SynCom）后，会在根区形成一个非典型细菌群落。一般来说，磷酸盐利用细菌在土壤中竞争磷酸盐的吸收，从而导致磷酸盐还原作用的激活。然而，PSR 损伤伴随着植物防御机制的转录变化，最终导致免疫激活增强，反之亦然。因此，SynCom 可增强 PHR1 的活性，而 PHR1 可直接调控一系列与根微生物组的组装密不可分的植物免疫系统基因。特别是，PHR1 负向调节一些植物免疫系统基因，这些基因会增加植物对病原体攻击的敏感性，但同时也会促进有益微生物的进入。一篇类似的文章报道了 PSR 基因损伤对植物微生物区系细菌组成的影响（与 P 水平无关），结果表明细菌微生物区系对土壤细菌群落组成有很强的依赖性，这与真菌微生物区系形成鲜明对比，这意味着植物对真菌的选择性要比对细菌的选择性强得多（Finkel 等人，2019 年）。一旦进入植物体内，宿主就会保持稳定的代谢物供应，以减轻内生菌的选择性压力，同时保证其长期持续的生物合成活性。然而，缺磷条件下的细菌和真菌群落组装实验存在可重复性低的问题，因此需要对这一课题进行更深入的研究。此外，还应开展进一步研究，以充分阐明 PSR 与调节根瘤沉积的遗传成分之间的联系。
图 6.1 缺磷引起的微生物群变化。植物相关微生物群是一个动态实体，会随着环境变化和植物营养状况而变化。由于土壤中可利用的磷酸盐比例很小，植物进化出了一种复杂的机制，既能感知 Pi 水平，又能吸引其他有能力溶解这种养分并增加其吸收的微生物。低水平的 H2PO4 -（绿色）会触发 PHR1 主调节器的激活，从而激活磷酸盐饥饿诱导（PSI）基因。其中一些基因参与调节根部分泌活动，而根部分泌活动反过来又在选择能提高植物韧性的根瘤菌中发挥作用。此外，磷酸盐平衡的变化激活了 PHR 蛋白质，从而允许 AM 真菌定殖，AM 真菌形成了紧密的菌丝网络，这对探索新的土壤龛位至关重要。在土壤中，微生物会降低环境的 pH 值并释放酸性磷酸酶，从而有利于将不可利用的 PO 4 3-（红色）分子转化为可利用的形式，即 HPO4 2- 和 H2PO4-（绿色）。另一方面，当土壤中的养分浓度较高时，磷酸盐会抑制 PHR1 的作用，从而影响 AM 的定殖，并间接改变土壤微生物群落。
6.6 整体大于部分之和：开发合成微生物群落（syncom）以提高植物的无机磷矿化和吸收率
过去几年中，测序技术和 Omics 方法的进步提高了土壤和不同植物器官中微生物群落的分辨率，但仍需全面了解地下发生的紧密的相互作用网络。因此，尽管人们对自然微生物群落的了解越来越多，但其内在的复杂性和多变性使其成为一个难以研究和界定的系统。为了克服自然界的复杂性，农业实践中采用了一种基于开发合成微生物群落的还原论方法。在这种情况下，有几类研究侧重于分离和鉴定 PSB 菌株，以进一步研究它们单独或与其他微生物结合对植物生长的促进作用和磷酸盐溶解作用。
复合群落可分为低复合群落（成员数量在 1 到 10 个之间）和高复合群落（包含 > 100 个微生物）。多年来，人们采用了多种方法来配制 SynCom，以便在接种到植物或土壤中时，在促进植物生长的效果和存活率之间实现最佳权衡。人们采用了自上而下和自下而上的方法来剖析自然微生物群落，并确定可用于农业的最佳候选微生物。其中，依赖培养的方法和测序技术一般用于确定在不同生物或非生物胁迫下能提高植物抗逆性的细菌菌株。然后，根据自下而上的程序，将筛选出的细菌分离物进行分组，以进一步筛选其组合效应。这类试验包括二元微生物-微生物相互作用试验、二元或复合植物-微生物相互作用试验以及功能基因组学方法。
基于 PSB 的 SynCom 的实际应用已经证明了其对植物生长和营养的积极影响。例如，在不同农业气候条件下的玉米和小麦作物土壤中接种两种 PSB 菌株，有利于提高作物生产力和土壤肥力，并增加谷物产量。不过，在处理的同时补充磷酸盐岩石时，这种有益效果更为明显，这可能是因为养分池中的磷得到了更好的利用。与未接种的小麦苗相比，PSB 还能提高小麦苗的发芽率和活力，与田间条件（17-18%）相比，盆栽小麦苗的谷物产量提高幅度更大（38.5%），这表明效率上的差距仍然限制着 PSB 在控制较少的环境中的使用。在一项类似的实验中，PSB 显著中和了土壤钙化和盐碱化过程中产生的副作用--土壤石灰化对植物生长的抑制作用，这表明它们可以在多种条件下应用。此外，使用这些生物肥料还能显著增加接种水稻（Oryza sativa L.）植株的芽高、芽干重、色素含量、磷吸收量和抗氧化活性。然而，当处理与减少 50% 的化肥同时进行时，这些参数的增幅最大。在番茄中接种两种不同的假单胞菌株 HT-RU47 和 RU47（已知在无机磷营养中发挥作用）后，也记录了植物生长促进作用、无机磷芽积累增加和无机磷矿化活性增加的情况。总之，PSB 是一种令人鼓舞的可持续工具，可提高作物产量和健康水平，尤其是在与减少剂量的常用肥料结合使用时。
总之，由于岩石磷酸盐储量有限，因此必须考虑到植物-真菌-细菌相互作用的复杂性，将其作为提高植物磷酸盐利用效率的来源，并意识到与单一菌株接种剂相比，由一种以上有益微生物组成的鸡尾酒会为植物带来更多的功能性益处。真菌和真菌菌丝是植物与细菌之间的桥梁，它们通过其柱外菌丝分泌以 C 为基础的代谢物，选择与之合作的微生物，提高其与植物碳水化合物交换矿质养分的能力。在这种情况下，PSB 的活动在提高有机磷矿化度方面发挥着根本性作用，与 AM 真菌一起，可以使植物生长得更健康，同时减少对环境的影响。要想在不影响土壤健康的情况下提高农业系统的可持续性，就必须共同努力，解开这一复杂的矩阵。
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