Abcam
小艾说
PD-1/PD-L1是什么？
1992年，日本京都大学Tasuku Honjo教授首次报道并克隆了PD-1基因 [1]。
1999年，华人学者陈列平教授报道了B7家族的第三个成员B7-H1（即日后的PD-L1）[2]。
2000年，Tasuku Honjo教授等人证明了PD-L1能与PD-1结合，进而抑制T细胞的增殖与细胞因子的分泌，负调控淋巴细胞的激活，从此，B7-H1被正式命名为 PD-L1（陈列平教授则继续使用“B7-H1”命名）[3]。
2003年，陈列平教授第一次成功地使用PD-L1封闭抗体联合T细胞回输技术治愈了约60%的头颈癌小鼠[4]。
2014年12月，首个应用于肿瘤治疗的抗PD-1抗体药Keytruda（MSD）获 FDA批准，三个月后，Opdivo （BMS）获FDA批准（Opdivo也将成为首个在中国大陆上市的PD-1单抗药）。
2016年FDA批准首个抗PD-L1的抗体药Tecentrip（Roche）应用于肿瘤治疗（图1）。
PD-1/PD-L1工作机制是怎样的？
PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂在癌症研究中倍受瞩目，而恶性肿瘤的十大重要标志之一就是免疫检查点参与的免疫逃避。
PD-1与其配体PD-L1的结合会下调T细胞的活性，阻断体内免疫系统对肿瘤细胞的攻击。PD-1/PD-L1单克隆抗体是目前临床研究与应用最广泛的免疫检查点抑制剂。
当阻断PD-1与PD-L1的结合时，负调控信号被阻断，T细胞恢复活性，杀死肿瘤细胞，在多种癌症治疗过程中显示出卓越的疗效[5]。
图 2：PD-1/PD-L1抑制剂的工作机理[6]
TCR, T cell receptor; MHC, major histocompatibility complex;
APC, antigen presenting cell
具体如图2所示，PD-1的生理功能简单来说就是免疫刹车：
当免疫系统发现外来入侵者，启动免疫攻击时，为了不误伤自身，同时也启动免疫“刹车”。因此，T细胞被激活时会表达PD-1, 而攻击性炎症因子IFN-γ会刺激细胞表达它的受体PD-L1和PD-L2。
当PD-1与它的受体结合，就会抑制免疫反应。但是狡猾的肿瘤细胞在与免疫系统的战斗中，逐渐学会了这一招：通过大量表达PD-L1实现免疫逃逸。而PD抑制剂，包括anti-PD-1或者anti-PD-L1单抗药，就是通过阻断PD-1与其受体的结合，重新激活免疫系统来攻击肿瘤细胞[6]。
为何要检测PD-L1？
PD-L1组成性低表达于抗原递呈细胞（APCs）、非造血细胞如血管内皮细胞、胰岛细胞以及免疫豁免部位（如胎盘、睾丸和眼睛）。炎性细胞因子如I/II型干扰素、TNF-α和VEGF等均可以诱导PD-L1的表达[7]。
大量研究表明，在癌症患者的样本中，PD-L1在很多情况下呈现高表达趋势[8]。在肿瘤微环境中，免疫抑制分子如PD-L1的高表达意味着当PD-1/PD-L1的结合被阻断时，患者更可能从中获益。因此对于癌症患者而言，如果PD-L1的表达水平较高，则使用PD抑制剂的疗效更为显著。目前的临床结果也印证了这一推测（图3,4）。正因为如此，PD抑制剂药物的使用，大多需要伴随/补充诊断检测PD-L1的表达，而PD-L1的检测方法主要是基于蛋白水平的免疫组化。
那么为什么不选择检测PD-1呢？在使用抗PD-1抑制剂的条件下，PD-1水平通常不会发生变化，此时检测PD-L1可以反映没有结合的PD-L1水平，从而反映药物的作用程度。而PD-L1在多种细胞表面表达，包括恶化的肿瘤细胞表面，所以高表达PD-L1的肿瘤细胞预示其免疫逃逸能力强，当使用PD抑制剂时可能更有效。当然也有报道，肿瘤浸润的T细胞中PD-1对于无进展生存期（PFS）也有一定的指示意义[10]。
关于OPDIVO(nivolumab，PD-1单抗药)，BMS进行了将其应用于NSCLC（非小细胞肺癌）的临床项目（图3）。
数据表明：PD-L1的表达与OPDIVO的疗效呈一定的正相关性。应用其伴随诊断抗体28-8 (ab205921, Abcam)的IHC染色信号越强，则使用OPDIVO所获得的总体生存率（OS）越高。PD-L1阳性表达组（≥1%）的总体生存率较之PD-L1阴性表达组（＜1%）有显著提升。当PD-L1的表达水平更高时（≥5%，≥10%），相应患者的死亡风险分别降低57%和60%。而对于Docetaxel（化学抗癌药）的使用，PD-L1的表达与总体生存率并无显著相关性[9]。
2017年马里兰大学Greenebaum癌症中心进行了针对多发性骨髓瘤（MM）的三联免疫治疗研究[10]，即PD-1单抗药，pomalidomide（免疫调节药物）及低剂量地塞米松的联合用药。研究使用PD-L1抗体28-8 (ab205921, Abcam)对病人的组织样本进行IHC染色，根据信号强度分为阳性与阴性/弱阳性两组，并观察两组病人在联合用药下的治疗反应（sCR/CR，得到了严格的完全缓解/完全缓解；VGPR，有非常好的部分缓解）。PD-L1阳性组vs阴性/弱阳性组的治疗反应（sCR/CR + VGPR）为54% vs 20%。
同时，研究对骨髓浸润的淋巴细胞中PD-1（ab52587，Abcam）的表达水平进行检测，发现其与客观缓解率（ORR）并无明显的相关性。目前，PD-L1表达水平的检测已经写进了肺癌NCCN指南。此外，一些临床试验的研究显示，在其它肿瘤中，PD-L1的表达水平与患者使用免疫检查点抑制剂的疗效亦存在相关性[8, 10]。
4：PD-1和PD-L1的免疫组化分析[10]
(A) MM患者组织样本中PD-L1的表达水平检测(DAB)，1% (i), 1% to 49% (ii), 50% (iii)，下方为相应的骨髓瘤细胞标志物MUM1 的组织染色（ACE）(B) T淋巴细胞中CD3染色 (i)和 PD-1染色 (ii)。
适用于IHC检测的PD-L1抗体有哪些？
目前FDA批准了2款PD-1抑制剂（Opdivo和Keytruda）和3款PD-L1抑制剂（Tecentriq、Imfinzi、Bavencio）上市。同时，也分别批准了相应的伴随/补充诊断抗体：28-8、22C3、SP142、SP263（克隆号，其中Bavencio无指定PD-L1诊断抗体）这4个PD-L1单抗，用于PD-L1表达水平的IHC检测[11]。
目前在NSCLC（非小细胞肺癌）治疗中，每个PD抑制剂都开发了相应的特异性PD-L1免疫组化（IHC）检测方法，以评估NSCLC中恶性肿瘤和/或免疫细胞上的PD-L1表达水平。前文已经提到OPDIVO(nivolumab，BMS)在NSCLC患者的治疗中获得了极大的成功，且疗效与PD-L1的表达水平呈现相关性，证明了补充诊断的重要性[9]。
下表列出了FDA以及在欧洲和日本批准的PD-L1单抗[12]：
bbreviations: IC, immune cells; IVD, in vitro diagnostic; NA, not applicable; NSCLC, non–small-cell lung cancer; NSQ, non-squamous; PD-L1, programmed death-ligand 1; SQ, squamous; TC, tumor cells.
*All assays score cells at any intensity.
†TC0＜1%, TC1 1% to＜5%, TC2 5% to , 50%, ＜50%, TC3 ≥50%, IC0＜1%, IC1 1% to＜5%, IC2 5% to , 10%, IC3≥ 10%.
表1：用于NSCLC IHC诊断的PD-L1抗体[12]
检测技术方面，如不同的检测抗体、平台以及不同阈值的问题；
生物学方面，如肿瘤内和肿瘤间异质性；
组织来源方面，如细胞学标本，存档标本与新鲜标本，原发部位与转移灶等。样本制备推荐参考FDA 批准的尿路上皮癌IVD分析中的操作（表2）
NBF, neutral buffered formalin; TC, tumor cell; UC, urothelial carcinoma，From here
除了染色技术外，抗体的特异性也尤其重要。而目前我国PD-L1的检测比较混乱：
染色技术及条件的不统一
染色的抗体多样
病理评价标准尚未统一
这些都导致患者检测PD-L1的价值降低。因此，选择合适的抗体至关重要。
推荐选择经FDA批准的克隆号28-8、SP142，用于IHC、WB、流式检测。点击下图查看详情：
有订制肿瘤免疫解决方案的用户，请点击下图或者阅读全文，下载肿瘤免疫解决方案手册（英文）。
1. Ishida, Y., et al., Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. EMBO J, 1992. 11(11): p. 3887-95.
2. Dong, H., et al., B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat Med, 1999. 5(12): p. 1365-9.
3. Freeman, G.J., et al., Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J Exp Med, 2000. 192(7): p. 1027-34.
4. Strome, S.E., et al., B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma. Cancer Res, 2003. 63(19): p. 6501-5.
5. Chen, D.S. and I. Mellman, Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature, 2017. 541(7637): p. 321-330.
6. Shukuya, T. and D.P. Carbone, Predictive Markers for the Efficacy of Anti-PD-1/PD-L1 Antibodies in Lung Cancer. J Thorac Oncol, 2016. 11(7): p. 976-88.
7. Grosso, J., et al., Programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in various tumor types. Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2013. 1(1): p. P53.
8. Patel, S.P. and R. Kurzrock, PD-L1 Expression as a Predictive Biomarker in Cancer Immunotherapy. Molecular Cancer Therapeutics, 2015. 14(4): p. 847-856.
9. PD-L1 IHC 28-8 pharmDx .pdf. 2015.
10. Badros, A., et al., Pembrolizumab, pomalidomide, and low-dose dexamethasone for relapsed/refractory multiple myeloma. Blood, 2017. 130(10): p. 1189-1197.
11. Ancevski Hunter, K., M.A. Socinski, and L.C. Villaruz, PD-L1 Testing in Guiding Patient Selection for PD-1/PD-L1 Inhibitor Therapy in Lung Cancer. Mol Diagn Ther, 2018. 22(1): p. 1-10.
12. Buttner, R., et al., Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. J Clin Oncol, 2017. 35(34): p. 3867-3876.
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