·论著·
薛丽佳1 黄巧容2 林辉1 崔贝贝1 李茜3 刘毅1
(1.四川大学华西医院风湿免疫科， 四川 成都 610041；2.四川大学华西医院干细胞生物学研究室， 四川 成都 610041；3.西南医科大学附属医院风湿免疫科, 四川 泸州646000)
【摘要】目的 探讨B淋巴细胞微粒(B-LMPs)在类风湿关节炎(RA)发病机制中的作用。方法 采用流式细胞术检测39例活动期RA患者(RA组)和24例健康体检者(健康对照组)外周血B-LMPs含量，检测RA患者外周血CRP、 ESR、RF、ACPA指标，分析B-LMPs含量与各指标相关性。其中20例有膝关节积液RA患者(关节液组)同时检测配对外周血和关节液B-LMPs含量。结果 RA患者外周血B-LMPs含量显著高于健康对照组(P<>P<>r=0.5431, P=0.0009),与ESR、CRP、RF、ACPA无相关性；而关节液B-LMPs含量与疾病活动性评分DAS28呈负相关(r=-0.470，P=0.0362)，与CRP、ESR、RF、ACPA无相关性。结论 RA患者外周血B-LMPs表达异常，且与疾病活动性显著相关，提示B-LMPs在RA疾病活动和关节损害中发挥重要作用。
【关键词】类风湿关节炎；B淋巴细胞微粒；流式细胞技术；关节液
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是风湿免疫科常见的自身免疫性疾病，以对称性关节破坏为主要表现，伴随慢性、进行性、侵袭性发病为主要特征[1-2]。既往研究认为RA的发病与免疫细胞活化和细胞因子参与有关；深入的研究发现，免疫细胞活化或凋亡可以分泌一种电镜下直径介于100～1000 nm的超微囊泡颗粒，称之为细胞微粒(cell-derived microparticles，MPs)[3],其具有源细胞表面抗原、蛋白质、核酸，还能参与体内炎症反应、凝血、新生血管生成以及传递生长因子等。根据这些MPs来源不同可分为血小板微粒(Platelet microparticles, PMPs)、内皮细胞微粒(Endothelial microparticles, EMPs)、单核细胞微粒(Monocyte microparticles, MMPs)以及淋巴细胞微粒(lymphocyte microparticles, LMPs)[4]等，LMPs又可以进一步分为B淋巴细胞微粒(B-LMPs)和T淋巴细胞微粒(T-LMPs)。
LMPs是由活化或凋亡的淋巴细胞出芽脱落形成的一种超微囊泡结构，静息状态下，细胞膜内层带负电荷的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺组成[5]，当细胞受到活化和外界刺激时，钙离子进入细胞内，影响细胞膜上的氨基磷脂特异性移位酶、非特异性脂质翻转酶、非特异性脂质爬行酶、钙离子依赖蛋白酶活性，随着磷脂酰丝氨酸翻转到细胞膜外层，细胞骨架发生伸展变形[6]，最终形成LMPs。LMPs能表达淋巴细胞表面标记物CD3、CD4、CD8、CD20，但是T-LMPs不能表达CD28和CD45[7]。有研究发现LMPs具有免疫调节、调控血管生成和调节血管张力等作用，在心血管疾病和糖尿病中均检测到LMPs的存在[8]。对于B-LMPs参与RA的发病炎症机制，国内研究较少，本研究通过比较RA患者外周血和关节液B-LMPs数量的变化，探索B-LMPs在RA发病中的作用。
1.1 研究对象 收集2014年12月至2015年7月四川大学华西医院风湿免疫科病房或门诊中重度活动期RA患者39例，其中女性34例，男性5例，平均年龄(48.95±14.30)岁。所有患者均符合1987年美国风湿病学会(ACR)修订的RA诊断标准或2010年欧洲抗风湿病联盟(EULAR)RA分类标准。疾病活动度判断采用疾病活动指数28(DAS28)，以DAS28≥3.2为疾病中重度活动。入选患者平均DAS28为(5.04±1.15),其中20例抽取膝关节液，标本采集前1个月患者未服用改善病情抗风湿药(disease modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)，未服用激素或口服低剂量激素(泼的松≤10 mg/d)。另纳入24例无免疫性疾病及近期感染史的健康体检者作为对照组，性别与年龄均匹配，其中女性19例，男性5例， 平均年龄(42.75±8.62)岁。健康组无关节积液。排除标准： ①急慢性感染；②恶性肿瘤；③合并或重叠其他结缔组织病；④糖尿病；⑤伴有过敏、哮喘等其他变态反应性疾病；⑥心血管疾病；⑦怀孕或哺乳患者。本研究获得四川大学华西医院医学伦理委员会批准，且取得受试者的知情同意。
1.2 试剂与仪器 APC-抗人Annxin V购自美国eBioscience公司，PECR-Cy5.5-抗人CD20抗体及相应同型对照抗体(美国Beckon-Dickinson公司)； Annexin V Binding Buffer(10×)购自美国Beckon-Dickinson公司；绝对计数荧光微球试剂盒购自美国 Beckman Coulter公司；黄色纳米荧光标准试剂盒, 流式细胞级别购自美国Spherotech公司。FACS Aria流式细胞仪购自美国BD公司，TCL-16高速离心机购自中国湘仪公司，不锈钢换膜过滤器购自美国Millipore公司。
1.3 研究方法
1.3.1 临床资料 详细记录每个RA患者的年龄、性别、病程、肿胀关节数(SJC)、压痛关节数(TJC)。
1.3.2 检测ESR、CRP、RF和ACPA水平 取RA患者清晨空腹静脉血以枸橼酸钠3.7 ml抗凝，同时无菌操作抽取RA患者的膝关节液5 ml至枸橼酸钠抗凝管中，分别采用魏氏法检测血沉(ESR)水平，速率散色比浊法检测C反应蛋白(CRP)和类风湿因子(RF)水平，ELISA法检测抗环网氨酸肽抗体(ACPA)水平。
1.3.3 流式细胞仪检测RA患者外周血和关节液B-LMPs数量 分别取外周血和关节液样本10 μL，加入1 μL APC标记的抗人Annxin V抗体和1 μL Annexin V Binding Buffer(10×)，避光孵育10 min后，加入1 μL PECR-Cy5.5标记的抗人CD20抗体，室温下避光孵育30 min，同时设同型对照反应管，以150 μL Annexin V Binding Buffer(1×)重悬细胞，并加入绝对计数荧光微球漩涡震荡后上流式细胞仪检测。
1.4 统计方法 采用SPSS22.0统计软件进行统计分析，两独立样本之间采用非参数检验Mann-Whitney U检验；两配对样本之间采用非参数检验Wilcoxon符号秩检验；Spearman直线相关分析及线性回归分析RA患者外周血、关节液MPs的水平与病情活动指标相关性，以P<0.05>
2.1 临床资料比较 RA组和关节液组在年龄、性别、病程、压痛关节数(TJC)、肿胀关节数(SJC)、ESR、CRP、RF阳性率、ACPA阳性率、DSA28率方面差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。
2.2 RA患者与健康对照组外周血B-LMPs比较 RA患者外周血B-LMPs表达水平高于健康对照组(P<>P<>
2.3 RA患者外周血、关节液B-LMPs与临床指标相关性分析 RA患者外周血B-LMPs数量与DAS28呈正相关(r=0.5431, P=0.0009)，与ESR、CRP、RF、ACPA无相关性；而关节液B-LMPs 数量与DAS28呈负相关(r=-0.4707,P=0.0362)，与CRP、ESR、RF、ACPA无相关性，见表3。
表1 临床资料比较
Table 1 Clinical characteristics of participants
临床表现RA组(n=39)关节液组(n=20)健康对照组(n=24)年龄(年)48.95±14.3051.16±11.9442.75±8.62性别(男/女)5/343/175/19病程(月)13.82±12.4213.20±11.60NA压痛关节数9.15±7.226.56±5.78NA肿胀关节数7.52±6.939.64±8.72NA血沉59.46±33.3953.55±37.61NAC反应蛋白44.10±46.0645.32±55.12NARF阳性率(%)79.585.0NAACPA阳性率(%)87.290.0NADAS285.04±1.154.93±0.99NA
注：RA: 类风湿关节炎； SF:关节液; SJC:肿胀关节数; TJC: 压痛关节数; ESR: 血沉; CRP:C-反应蛋白； RF: 类风湿因子; Anti-CCP: 抗环瓜氨酸肽抗体；DAS 28: 28个关节活动度指标。
表2 4组B-LMPs检测值
Table 2 Detection of B-LMPs in plasma and synovial fluid
组别nB-LMPs含量(μL)健康对照组24361.83±628.80①RA组391190.72±3052.93RA外周血组20823.56±1684.88②RA关节液组203566.05±8098.31
注：与健康对照比较，①P<>P<>
表3 RA患者B-LMPs与临床指标相关性分析
Table 3 Correlation of B-LMPs counts in plasma of RA patientsand synovial fluid of RAwith clinical parameters
患者外周血B-LMPsrP患者关节液B-LMPsrPDAS280.54310.0009①-0.47070.0362②CRP-0.27170.0943-0.21540.3618ESR0.09700.5569-0.38140.1072RF-0.07830.67020.66020.8303ACPA0.13100.43950.10280.6849
注：①P<>P<>
RA的发病伴随各种炎症反应和免疫细胞活化，在关节滑膜处炎性因子的浸润，最终导致关节破坏是RA的主要临床特点。近年来随着MPs的研究深入，发现其不仅是一种细小的碎片，更具有生物学活性物质，参与细胞间信号传递、免疫调节、炎症反应等[10]；来源于活化B淋巴细胞的B-LMPs，在某种程度上也参与了RA的免疫调控阶段[15]。
已有研究发现，B-LMPs能诱导单核细胞产生炎症因子IL-1和TNF-α，介导慢性炎症。Baka等[12]在皮肌炎和多肌炎患者外周血检测到T-LMPs和B-LMPs数量明显增加，且与抗JO-1抗体、肺损伤程度相关，提示LMPs可能参与炎性肌病的发病。有研究表明，硬皮病患者外周血中PMPs、LMPs及EMPs含量均升高[13- 14]。Berckmans等[15]最早研究了RA患者外周血和关节液中的细胞微粒，其中关节液中B-LMPs含量约为(10～304)×106/L，与外周血(10～31)×106/L相比，差异无统计学意义，在RA关节液中仍以T-LMPs和MMPs为主。本研究发现RA患者外周血中B-LMPs的含量显著高于健康对照组，而Berckmans等[15]的研究则未观察到差异存在。既往有报道LMPs可以通过巨噬细胞调节免疫反应，当LMPs被小鼠单核细胞白血病RAW264.7细胞吞噬后，诱导其凋亡，巨噬细胞得到活化继而释放炎症因子[16]。LMPs在调节血管生成方面同时具有抑制和促进两种功能，低浓度的LMPs能减少内皮细胞上一氧化氮的产生，这一过程依赖P13K途径，从而导致内皮细胞损害和血管生成受损，而高浓度LMPs能直接改善内皮细胞的功能，一方面，LMPs增加血管内皮生长因子、IL-1β、细胞粘附分子的表达，促进一氧化氮释放和促进血管生成[17-19]。另一方面， LMPs表达音猬因子(sonic hedgehog，shh)基因、shh蛋白，作用于血管内皮生长因子。Distler等[20]发现，LMPs促进关节滑液中成纤维细胞金属基质蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)、MMP-3 、MMP-9、MMP-13的表达。
本研究发现RA患者外周血中B-LMPs含量均显著高于健康对照组，提示B-LMPs参与了RA的免疫反应，而RA患者关节液中B-LMPs含量较外周血相比明显增高，B-LMPs作用与滑膜成纤维细胞，释放众多炎症因子，进一步吸引白细胞聚集在关节腔中产生炎症反应。由于RA患者关节液中的B-LMPs作用于滑膜成纤维细胞，释放IL-6、IL-8、单核细胞趋化因子(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)以及MCP-2，进一步吸引白细胞聚集在关节腔中产生炎症。这与我们观察到外周血B-LMPs与疾病活动度DAS28呈正相关，而RA关节液中B-LMPs与疾病活动度DAS28呈负相关一致，推测B-LMPs可作用与滑膜成纤维细胞相互作用，升高的炎症因子在某种程度上会抑制炎症因子的产生。
本研究结果显示，RA患者外周血中B-LMPs水平与炎症指标密切相关，在一定程度上反映了体内炎症水平，但尚需探索B-LMPs水平与RA局部关节破坏的关系，PMPs的检测对RA早期诊断和病情监测具有重要的临床价值。PMPs不仅参与血栓形成和动脉粥样硬化，在RA炎症反应及免疫调节中也发挥了重要作用。
目前有关B-LMPs在炎症状态下的病理生理特性，B-LMPs对RA的影响机制尚不十分明确，未来还将探讨B-LMPs功能以及与其他免疫细胞的相互作用，从而为深入认识RA分子机制，寻找新的RA治疗靶点提供依据。
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XUE Lijia1,HUANG Qiaorong2,LIN Hui2,et al
(1. Department of Rheumatology and Immunology, West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China;2. Laboratory of Stem Cell Biology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China;3. Department of Rheumatology and Immunology，Southwest Medical University，Luzhou 646000, Sichuan, China)
【Abstract】Objective To test the expression of B-lymphocyte Microparticles (B-LMPs) in rheumatoid arthritis (RA) patient’s plasma and synovial fluid and compare the difference between patients and healthy controls (HC).Methods The levels of B-LMPs in plasma were detected by flow cytometry in 39 active RA patients and 24 healthy volunteers. Synovial fluid (SF) was collected from 20 patients. Clinical parameters including CRP, ESR, RF, ACPA in the patients and volunteers were observed and analyzed. The potential correlation of B-LMPs counts and clinical parameters was analyzed. Results The B-LMPs levels in SF from RA patients were higher than paired plasma (P<0.05) and="" in="" plasma="" from="" hc="">P<0.01). the="" levels="" of="" plasma="" b-lmps="" were="" positively="" correlated="" with="" disease="" activity="" score="" das28="">r=0.5431, P=0.0009) and not correlated with ESR, CRP, RF and ACPA. B-LMPs levels in SF were not correlated DAS28, ESR, CRP, RF and ACPA (P>0.05). Conclusion B-LMPs may be involved in immune regulation and systemic inflammation of RA. The elevated levels of PMPs could be a potential biomarker for RA.
【Key words】Rheumatoid arthritis; Flow cytometry; B-lymphocyte Microparticles; Synovial fluid
基金项目：国家自然科学基金(81102274)；四川省科技厅国际合作项目(2014HH0027)；成都市科技攻关项目(10GGYB644SF-023)
通讯作者：林辉，博士，副主任医师，本刊审稿专家，E-mail：lhacd@163.com
【中图分类号】R 593.22
【文献标志码】A
doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.11.006
(收稿日期：2016-07-01；
修回日期：2016-08-13； 编辑： 黎仕娟)
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