专利名称酿造
慕萨莱思的高温酵母、制备方法及制备的慕萨莱思的制作方法
技术领域本发明涉及微生物及发酵工业领域。具体的说，本发明涉及一种
新疆慕萨莱思酿造的酵母菌、制备方法及其获得的饮品技术领域。
背景技术慕萨莱思是西域最古老的葡萄酒，民间也称作“穆萨莱斯”、“穆塞勒斯”、“姆塞来斯”、“
木赛来斯”和“美赛来斯”、“慕萨莱思”、“
穆塞莱斯”等。中国唐代诗句“
葡萄美酒夜光杯，欲饮瑟琶马上催”中的“葡萄美酒”指的就是穆塞莱斯。
高昌王向唐朝进贡的“西域琼浆”也是穆塞莱斯。“葡萄独不用曲”(明朝
李时珍《本草纲目》卷二十五)，慕萨莱思就是用
葡萄汁自然发酵而成，不勾不兑，无任何“曲”类添加剂，因此被认为是古代西域葡萄酒的“活化石”。民间历来酿造慕萨莱思极为普遍，“村村舍舍煮酒忙，香气氤氲漫农家”。群众饮慕萨莱思往往以酣为快，酣后意恣，高歌狂舞，尽兴而怡然，再现了古代西域文化的遗风，是古代西域文化的余绪。慕萨莱思已成为
新疆特产，主产地在
阿瓦提县，在新疆的阿瓦提县，几乎家家户户都
酿酒。同一个村庄里，即使有上百户人家，也不会有一种相同的穆塞莱斯。这与酿酒人的年龄、性格、心情等有关，他们把自己的个性融人了穆塞莱斯中了，是一种酿造的味美醇香的葡萄酒，药用价值高，富含人体所需的氨基酸、多种维生素、葡萄糖、铁等营养成分和微量元素。慕萨莱思属温性，是一种纯天然绿色饮品，至今沿袭着祖辈的酿造工艺，使得慕萨莱思以最老的方式保存了下来，堪称刀郎文化的精髓与灵魂。慕萨莱思酒是新疆
维吾尔民族利用鲜食或兼食性的葡萄取汁、熬煮、发酵而成的一种天然酒精饮料。慕萨莱思的酿造工艺与葡萄酒工艺有着很大的不同。其基本工艺为
维吾尔人将葡萄榨汁，先将
皮渣加水熬煮(水刚没过皮渣)熬煮，之后过滤，滤液与压榨汁混合后再熬煮，形成慕萨莱思起始发酵液，自然冷却至室温，装入大缸进行自然发酵而成。偶尔酿造者根据自己的需求会添加一些当地出产的
大芸、
白杏、
桑椹、
红花、枸杞、鸽子、雪鸡、鹿血，甚至是新疆的烤全羊。作为具有保健功效及丰富文化底蕴的原生态饮品，慕萨莱思逐步成为当地经济发展的重要组成部分，慕萨莱思市场的迅速扩大与人民对其消费需求的迅速增长，传统慕萨莱思逐步暴露出其产量不足，质量层次不齐等先天性缺陷，已经不能保证慕萨莱思的规模化持续发展，慕萨莱思的改革与创新为慕萨莱思进一步发展的迫切任务。由于慕萨莱思的原生态性，也严重制约了慕萨莱思产业化发展。在当地家家可以酿造慕萨莱思，但是酿造出的产品参差不齐，而且工艺还很落后，人才匮乏真正掌握能酿造高品质的慕萨莱思的技师寥寥无几，有的也只是掌握了祖辈的酿造经验而已，对于规模化的科学生产却不能适应。由于慕萨莱思的酿造工艺不同于普通葡萄酒的工艺，所以对于慕萨莱思的酿造来说葡萄酒酿造师是一片陌生的领域。传统慕萨莱思酿制的关键工序为熬煮与发酵工序，其中发酵工序受到野生菌种、自然环境条件及发酵设备等因素的影响，是引起慕萨莱思质量波动的重要因素，是限制慕萨莱思规模化生产的最主要因子。例如，在慕萨莱思完全自然发酵过程中，由于受到新疆早晚大幅度温差波动，发酵过 程中大量生物热等的影响，造成发酵醪品温要么过高，高达37°C，要么过低，低达13°C，常常发生延迟启发，停滞发酵，提前结束发酵等现象，使得发酵周期由15d到45d不等，同样的熬煮发酵醪，但最终的慕萨莱思产品质量如酒精、酸、涩、苦等有某单项感官特征突出到各种滋味与香味协调怡人的高品质不等。又由于在市场利益的驱动下，人们随意改变熬煮与发酵设备等，使得传统慕萨莱思酿造工艺更加复杂化，对传统慕萨莱思的发展产生负面影响。现有技术研究表明，环境因子对葡萄酒酵母多样性的形成具有重要作用，慕萨莱思酵母菌多样性及遗传多样性与慕萨莱思独特的酿制环境有关，环塔里木盆地的极端内陆气候，其干旱、少雨、无霜期长等均有可能影响当地酵母的多样性。此外，与采样点之间在原料选择，取汁方式，熬煮方式与时间，自然发酵容器、周期等工序上以及制作过程中卫生防控相关联。不同的取汁方法也可能导致葡萄汁中酵母菌数多样性不同，这些都需要采用科学的技术手段加以研究和攻关。目前国内，有对慕萨莱思酿制中野生优势菌的报道，但没有适宜于地方慕萨莱思复杂酿制环境的优良菌株及其配套酿制工艺的报道。针对目前慕萨莱思发展处于传统加工与现代化生产交汇阶段，传统工艺革新是慕萨莱思发展的历史性任务。依据慕萨莱思的酿制的科学原理，对慕萨莱思酿制核心技术，即自然发酵工序进行科学分析，筛选研制适宜于慕萨莱思现代化生产优良菌种和适合稳定工业化生产的工艺，同时又最大水平保留传统慕萨莱思优质品质特征的先进工艺是对传统慕萨莱思改进的根本。
发明内容针对目前国内外没有发酵性能优良、耐受性好的慕萨莱思专用酵母，本发明提供一种耐受性好，发酵性能优良的高温酵母菌种、确定的生产慕萨莱思的工艺及其制备获得的慕萨莱思。本发明从新疆阿克苏地区、和田地区和喀什地区慕萨莱思产区不同慕萨莱思的自然发酵液中取样，筛选出一批生长良好的酵母菌株，从中优选出一株编号为GTGM-E2的高温酵母菌株，经鉴定为酵母菌，该菌株确定的发酵工艺能生产慕萨莱思。
本发明具体提供了一种耐受性好，发酵性能优良的高温酵母菌种，编号命名为GTGM-E2，参照J.A巴尼特和R.W佩恩编著的《酵母菌的特征和鉴定手册》，依据Barnett等编著的《酵母菌:特征与鉴定》，张纪忠的《微生物分类学》及Cavazza (1992)等人及杨莹(2007)等人的文献报道，对GTGM-E2菌株进行形态学及生理生化学鉴定，GTGM-E2菌株于申请日前已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101,保藏日期是2013年04月23日，保藏号是CGMCC N0.7513。经微生物学鉴定为酿酒酵母{Saccharomyces cerevisiae)。该酵母经WL营养琼脂培养基培养，菌落特征为奶油色，带或不带淡淡的绿色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油状；YPD固体培养菌落为乳白色，奶油状，表面平滑，边缘整齐；YPD液体培养基培养无膜或蹼，试管底部具有白色紧实沉淀；细胞形态为圆形或椭圆形，多端出芽，产孢子，孢子为圆形，孢子囊中有I个 4个孢子，利用赖氨酸培养基进行选择性培养，不生长；可发酵葡萄糖，菊糖，乳糖，棉子糖，麦芽糖，蔗糖，可同化的碳源为:葡萄糖，半乳糖，甲基葡萄糖甙，乳酸，乳糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、海藻糖、松三糖、棉子糖、N—乙酰氨基葡萄糖、蜜二糖、木糖醇、丙三醇、山梨醇、赤鲜醇、环乙糖胺及肌醇柠檬酸测试均显示阴性，不能利用硝酸钾，脲酶试验、DBB实验、抗0.01%及0.1%放线菌酮实验及无维生素生长实验均为阴性；通过上述结果及经过26S rDNA同源分析、系统发育分析结果，将编号为GTGM-E2菌株鉴定为酵母属 iSscchaxomycGS)中的酿酒酵母 iSscchaxomycGS cerevisiae)。同时，本发明在提供GTGM-E2酵母菌株的基础上，进一步提供了一种慕萨莱思的生产工艺，具体步骤如下:
(I)酒母制备:将酿酒酵母 i^3cchaxomycGS cerevisiae) GTGM-E2 CGMCC N0.7513 在YPD固态培养基上的新鲜培养物，接入24Brix的葡萄熬煮汁中，28°C培养24h，备用。(2)原料拣选与冲洗:人工将石子等异物及霉烂、青果等从葡萄原料中拣选出，拣选干净的葡萄利用自来水将泥沙冲洗干净。(3)榨汁:利用破碎机将上述步骤(2)拣选与冲洗后的葡萄除根破碎后，利用螺旋压榨机进行压榨，将葡萄汁泵入缓冲池，进行静止沉淀，而后打入蒸煮锅。(4)熬煮:将步骤(3)榨出的葡萄皮渣中加入以淹没皮渣为宜的水量，熬煮2h 6h，熬煮好的皮渣水进行过滤，过滤后的皮渣水与压榨后的葡萄汁以1:3 1:8 (v:v)的比例打入蒸汽锅进行煮沸熬煮，定期检测糖度终了糖度为22Brix 25Brix。(5)冷却:关闭蒸汽，用冷却水将步骤(4)熬煮汁进行冷却，冷却到35°C进行打入发酵容器中。(6)发酵:将步骤(I)制备新鲜的酒母，按总发酵液的1%(ν/ν)接种量接入冷却后的葡萄熬煮汁，接种温度为32°C 35°C，环境温度20°C _30°C进行发酵，品温为25°C 370C，适宜温度为28°C，定期检测糖度，直至糖度不再降低为止。
(7)后熟，杀菌及灌装:发酵结束后，进行后熟，后熟温度不得超过25°C，酒与酒渣放置4(T45d，将上清液导入干净容器中，在灌装前进行65°C 75°C杀菌30min，冷却并将温度降至室温，而后进行灌装；若不及时灌装，将容器装满，在灌装前的杀菌条件同上。本发明中选用的酵母菌分离培养基如下:
YPD液体培养基(g /L):葡萄糖20 g,蛋白胨20 g,酵母膏10 g,溶于蒸懼水并定溶至1000 mL, pH值自然。YPD固体培养基加20 g琼脂，121°C高压灭菌20 min ；WL营养琼脂培养基(g /L):酵母浸粉4 g,蛋白胨5 g,葡萄糖50 g,磷酸二氢钾0.55 g,氯化钾0.425 g,氯化钙0.125 g，硫酸镁0.125 g，氯化铁0.025 g，硫酸锰0.025 g，琼脂20 g，溴甲酚绿22mg, pH 6.5,121。。灭菌 20 min。菌株酿酒酵母(feccAaro焊Ce1Scerevisiae) GTGM-E2 CGMCC N0.7513 保藏用保护剂:甘油
(I)本发明中选用的酿酒酵母鉴定培养基及试剂=YPD固液态培养基同上；WL营养琼脂培养基同上；Gorodkowa培养基:葡萄糖0.1%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，琼脂2%，，pH值自然，121°C灭菌20 min ;赖氨酸培养基，IL中含有:D_葡萄糖10g，L-组氨酸lmg，DL-蛋氨酸2 mg, DL-色氨酸2mg,对-氨基苯甲酸200 Kg,生物素20 Kg,叶酸2 Kg,肌醇IOmg,烟酸400 Kg,泛酸2mg,盐酸批卩多醇400 Pg,核黄素200 Kg,盐酸硫胺素400 Pg,硼酸500 Pg,结晶氯化铜40 Pg，碘化钾100 Pg，结晶氯化铁200 Pg，结晶硫酸锰400 Pg，结晶钥酸钠200Kg，结晶硫酸锌400 Pg,磷酸二氢钾850 mg,磷酸氢二钾150 mg,结晶硫酸镁500 mg,氯化钠100 mg，结晶氯化钙100 mg，赖氨酸盐酸盐2.5 g，琼脂20 g，pH值自然，121°C灭菌20min ；
(2)生理生化鉴定培养基:糖发酵培养基:0.5%酵母浸出物，121°C灭菌20min ;碳源基础养基:(NH4) 2S04 0.5%, KH2P040.1%，MgS04.7H20 0.05%,酵母膏 0.02%,水洗琼脂 2%,115°C灭菌15min ;氮源基础培养基:每升含有碳源(D-葡萄糖)10g,氨基酸(L-组氨酸Img,DL-蛋氨酸2mg, DL-色氨酸2mg),生长因子(对一氨基苯甲酸200ug,生物素20ug,叶酸2ug,肌醇IOug,烟酸400ug,泛酸2mg,盐酸批卩多醇400ug,核黄素200ug,盐酸硫胺素400ug),微量元素(H3BO3 500ug, CuSO4.5H02 40ug)，盐类(KI IOOug, FeCl3.6H02 2 00ug, MnSO4.4H02400ug，Na2MoSO4.2H02 2 00ug, ZnSO4.7H02 400ug),同化氮源，选择硝酸钾；脲素培养基:蛋白胨0.1%，磷酸二氢钾0.2%，氯化钠0.5%，酚红0.0012%,琼脂2%，PH6.8灭菌后加入经过滤除菌尿素溶液，是尿素的最终浓度达到2% ;抗放线菌酮培养基:每升中含有氨基酸(L-组氨酸IOug, DL-蛋氨酸20ug, DL-色氨酸20ug),3.5g硫酸铵以及0.01%和0.1%的放线菌酮，其余成分同氮源基础培养基；无维生素生长测试培养基:每升中含有氨基酸(L-组氨酸IOug, DL-蛋氨酸20ug, DL-色氨酸20ug), 5g硫酸铵,不含生生长因子,其余同氮源基础培养基。序列分析试剂:Tris(Amresco), SDS (Amresco), EDTANa2 (Amresco), DNA MarkerDL2000 (广东东盛生物科技有限公司)，TE缓冲液，琼脂糖(西班牙)，2 X Tag PCR MasterMix购自诺维森(北京)生物科技有限公司；TAE缓冲液(50X贮存液pH8.5，242 g Tris碱，57.1 mL 冰醋酸，37.2 g Na2EDTA.2Η20，加 ddH20 至 I L，用时稀释到 IX)，通过 26SrDNA 引物测序，具体采用 26S rDNA 引物:NLl (5' -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')；NL4 (5' -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')，序列具体参见序列附表。本发明还进一步提供了利用高温菌株GTGM-E2发酵制备得到的慕萨莱思，具备优良品质的慕萨莱思广品。(I)理化指标:酒精度:10 13% (V/V)；总糖:< 6="" g/l="" ；总酸:6="" 9g/l。(2)感官指标:色泽:具有慕`萨莱思的典型色泽特征，棕褐色，色泽幽暗，均匀浑浊；气味:具有突出的焦糖香味，酒香馥郁、纯净，典型性强；口感:口感丰满，协调性好，余味悠长，典型性强。本发明提供慕萨莱思理化指标测试采用的方法:总糖的测定:gb/t="" 15038-2006直接滴定法；酒精度的测定:gb/t="" 15038-2006酒精计法；总酸:gb/t="" 15038-2006电位滴定法；还原糖:gb/t="">
(I)本发明提供一株发酵性能良好，耐受性好的高温酿酒酵母iSaccharotnycescerevisiae)CGMCC N0.7513，弥补了目前慕萨莱思专用酵母缺乏的现状，特别是
适合高温发酵的慕萨莱思专用酵母。(2)本发明对传统慕萨莱思产业、酿制工艺、品质特征等具体掌握基础上，进行大规模的慕萨莱思酵母分离与筛选，并对筛选株进行工厂化慕萨莱思发酵实验，获得优势优良酿酒酵母菌，完成适宜于高端慕萨莱思的高温纯种发酵工艺的研制。获得了优良的慕萨莱思产品，其色泽幽暗，为慕萨莱思特有的纯正棕褐色，浑浊均匀，具有突出的焦糖香味，酒香馥郁、纯净，口感丰富，具有良好的协调性，余味悠长，丰富了目前我国果酒产品市场。
附图说明图1显示为慕萨莱思高温发酵工艺流程图。图2 显示为酿酒酵母 i^scctmromycGS cerevisiae) GTGM-E2 CGMCC N0.7513 菌落形态图，图中，上半部分图为YPD培养基上菌落形态，下半部分图为WL培养基上菌落形态。图 3 显示为酿酒酵母 i^scctmromycGS cerevisiae) GTGM-E2 CGMCC N0.7513 细胞形态及孢子形态图，图中，上半部分图为细胞形态，下半部分图为孢子形态。图 4 显示为酿酒酵母 i^scctmromycGS cerevisiae) GTGM-E2 CGMCC N0.7513 系统发育进化树图。图5显示为慕萨莱思传统自然发酵降糖Logisic曲线拟合图。图 6 显示为采用酿酒酵母 i^scctmromycGS cerevisiae) GTGM-E2 CGMCC N0.7513高温发酵制备慕萨莱思Logisic降糖曲线拟合图。图7显不为慕萨莱思米用自然发酵与酿酒酵母cerevisiae)GTGM-E2 CGMCC N0.7513高温发酵时降糖(Brix)速率图。
具体实施例方式主要仪器与设备:PL202电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；HPX_9272数显电热培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LDZX-40BI高压灭菌器，上海申安医疗器械厂；GZX-9420电·热恒温鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司；SW-CJ-2F超净工作台，上海博迅实业有限公司；HHW.21.600电热恒温水浴箱，北京永光明医疗仪器厂；fcycler96孔PCR反应仪，Bio-Rad公司；DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂；GEL Doc2000凝胶成像分析仪，Bio-Rad公司；HPX-9272 MBE数显电热培养箱、SW-CJ-2F超净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LHS-250SC恒温恒湿培养箱，常州中捷实验仪器制造有限公司；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂；Biolog,美国BioTek Instruments公司；游标卡尺，上海工量具有限公司；WHB 96微孔板，上海市蔚宏生物科技有限公司；1000 ml移液枪，上海艾本德生物技术国际贸易有限公司；HPX-9272 MBE数显电热培养箱、SW-CJ-2F超净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；C21-RT2103电磁炉、EG720FF1-NR微波炉，广东美的生活电器制造有限公司；G4B20C5E1C6B71旋蒸蒸发仪，日本Eyela公司。BL3100电子天平，德国Sartorius公司；SCW-CA_650桌上型垂直流洁净工作台，苏州宏瑞净化科技有限公司。G4B20C5E1C6B71旋蒸蒸发仪，日本Eyela公司。BL3100电子天平，德国Sartorius公司。手持糖度计，上海天垒仪器仪表有限公司；酒精计，上海医联控温仪器厂。PHS-3B型pH计，上海红益仪器仪表有限公司；HH-2数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；25 L发酵罐(工厂)及陶瓷发酵罐(作坊),市售。选用的原料为和田红葡萄，产自于新疆南疆环塔里木盆地地区。本发明中选用的所有菌种和原辅材料，以及选用的菌种培养条件和方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％—般为重量之比，个别不同之处另作说明。实施例一:菌种的筛选、分离、纯化和鉴定 菌株分离方法
1.酵母分离源的采集:2010年9 10月采集于南疆地区8个具有典型慕萨莱思酿造工艺作坊和工厂49份样液。样液包括新压榨的含有皮渣的或不含皮渣的葡萄汁、正在熬煮的葡萄汁、O d (起始发酵液，即冷却后的葡萄熬煮汁)发酵液以及来自大小不等(50 -500L)的瓷坛或不锈钢发酵罐(20 t)中不同时期发酵液。采样用厂家专用酉取工具将样液取出立即装入塑料瓶中(样液润洗3次)再用润洗过(样液润洗3次)的注射器吸IOmL样液至已灭菌带塞的20 mL小玻璃瓶中，盖好瓶塞用封口膜密封放入4 °C保温瓶中，12 h内将样品运回实验室并与灭囷甘油1:1混合，放入_20 C冰箱中保存备用。2.菌种分离与纯化方法:将所采样品做10的稀释梯度，取其适宜的3个连续稀释梯度，各取0.1mL，涂布于WL与YPD固体培养基，于恒温养箱中28 °C培养2 3 d，挑取单菌落，在YPD固体培养基上纯化培养后，进行甘油管_20°C保藏备用。未发酵的样品分离菌株控制在15 20株/样，发酵期的样品分离株控制2(Γ40株/样。菌种的分离鉴定方法
1.酵母菌的形态学鉴定:菌落形态观察:将酵母在YPD及WL固体培养基上划线，28°C培养2 3 d，观察其菌落形态；细胞形态观察:YPD液态接种28°C培养2天，显微镜观察；孢子形态观察:G0r0dk0wa培养基28°C培养7天，采用孔雀绿一蕃红染色法将孢子进行孢子染色，显微镜观察。液体培养特征观察:将菌种接种到YPD液体培养基中，28°C培养2 3 d，观察是否发酵、培养液是否混浊，是否形成环或岛等膜蹼，沉淀量多少及松紧状况。2.赖氨酸选择性培养鉴定:菌株接种到YPD液体培养基活化24h后，按照1%的接种量接种到2 mL的无菌水中进行饥饿处理，7d后，划线接种到赖氨酸培养基，28°C培养5d后观察是否有酵母生长，培养48h后没有菌落出现的继续培养，直到15d后仍无菌落生长的说明可能是酿酒酵母。测试结果为在赖氨酸培养基上不生长者为酿酒酵母。通过上述酵母菌分离与形态学试验鉴定获知。
49份样液共分离到699株酵母菌，见表1，根据酵母菌在WL培养基上的形态和颜色，可将阿瓦提县不同发酵工艺慕萨莱思样液中分离到的699株酵母菌聚为20个培养类型，其中482株WL培养菌落特征为将奶油色，带或不带淡淡的绿色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油状，YPD固体培养菌落为乳白色，奶油状，表面平滑，边缘整齐，YPD液态培养无膜或蹼，试管底部具有白色紧实沉淀；继而将这些菌株利用赖氨酸培养基进行选择性培养鉴定，每株菌做三个重复，筛选不能生长的酵母有436株。对436株典型菌株进行细胞形态及孢子形态观察复检，进一步确认其分类地位。通过上述形态鉴定及赖氨酸选择培养，将699分离株中436株初步鉴定为酿酒酵母，其中包括编号为GTGM-E2菌株，其菌落形态及显微形态参见附图2、附图3。生理生化鉴定:
依据形态及赖氨酸选择性培养基初步确定编号为GTGM-E2的菌株进行糖发酵、碳氮源同化，抗防线菌酮，无维生素生长，尿素分解，重氮基蓝B等实验，进行生理生化鉴定。糖发酵实验:在糖发酵培养基分别加入葡萄糖，菊糖，乳糖，棉子糖，麦芽糖，蔗糖利用杜氏管发酵法在28°C，培养I周，其间每天观察并记录杜氏管内气体积存与否及其积存量，检测是否对测试糖具有发酵力。碳源同化实验:生长普法，在氮源基础培养基中，测试葡萄糖，半乳糖，乳糖，鹿糖，麦芽糖，纤维二糖，甲基葡萄糖甙，木糖，阿拉伯糖，海藻糖，松三糖，棉子糖，N —乙酰氨基葡萄糖，蜜二糖，木糖醇，丙三醇，山梨醇，赤鲜醇，环乙糖胺，肌醇，乳酸，柠檬酸，28°C培养2 3天后观察记录结果，检测其是否生长。硝酸盐同化实验:生长普法，在碳源基础培养基中，加入硝酸钾，28°C，2 3天后观察记录结果，检测其是否生长。脲酶试验:把脲素液体培养基用无菌操作，以0.5mL为一份分别放进许多试管中，并且深度冷冻储存六周。取一环生长I天或2天的酵母菌培养物，接种在上述培养基中，在37°C培养。每半小时检查一次试管颜色的变化，红色表示脲酶活性.所有呈阳性反应的酵母菌在4小时之内都能变成红色。重氮基蓝B (DBB)试验:把培养在YPD固体培养基上至少10天的菌种，放在55°C数小时，然后浸淹在冰冷的DBB试剂中.如果该培养物在室温下2分钟内变成暗红色，那么该结果被记录为阳性。抗放线菌酮实验:将新鲜活化的测试菌接入含0.01%及0.1%的培养基中进行28°C培养2-3d，观察期生长状况。表I 慕萨莱思酵母菌分离源及分离株数
权利要求1.一种能生产慕萨莱思的高温酿酒酵母cerevisiae) GTGM-E2,该酿酒酵母 iSacclmromyces cerevisiae) GTGM-E2 的保藏号为 CGMCC N0.7513。
2.一种利用权利要求1所述的酿酒酵母i^3cchaxomycGS cerevisiae) GTGM-E2生产慕萨莱思的方法，其特征在于，所述方法具体步骤包括: (1)酒母制备:将酿酒酵母i^3cchaxomycGS cerevisiae) GTGM-E2 CGMCC N0.7513 在YPD固态培养基上的新鲜培养物，接入24Brix的葡萄熬煮汁中，28°C培养24h，备用； (2)原料拣选与冲洗:人工将石子等异物及霉烂、青果等从葡萄原料中拣选出，拣选干净的葡萄利用自来水将泥沙冲洗干净； (3)榨汁:利用破碎机将上述步骤(2)拣选与冲洗后的葡萄除根破碎后，利用螺旋压榨机进行压榨，将葡萄汁泵入缓冲池，进行静止沉淀，而后打入蒸煮锅； (4)熬煮:在步骤(3)榨出的葡萄皮渣中加入以淹没皮渣为宜的水量，熬煮2h 6h，熬煮好的皮渣水进行过滤，过滤后的皮渣水与压榨后的葡萄汁以1:3 1:8 (v:v)的比例打入蒸汽锅进行煮沸熬煮，定期检测糖度终了糖度为22Brix 25Brix; (5)冷却:关闭蒸汽，用冷却水将步骤(4)熬煮汁进行冷却，冷却到35°C打入发酵容器中； (6)发酵:将步骤(I)制备的新鲜酒母，按总发酵液的1%(ν/:ν)接种量接入冷却后的葡萄熬煮汁，接种温度为32°C 35°C，环境温度20°C _30°C进行发酵，品温为25°C 37°C，适宜温度为28°C，定期检测糖度，直至糖度不再降低为止； (7)后熟，杀菌及灌装:发酵结束后，进行后熟，后熟温度不得超过25°C，酒与酒渣放置4(T45d，将上清液 导入干净容器中，在灌装前进行65°C 75°C杀菌30min，冷却并将温度降至室温，进行灌装；若不及时灌装，将容器装满，在灌装前的杀菌条件同上。
3.一种利用权利要求1所述的酿酒酵母cerevisiae) CGMCC N0.7513和权利要求2所述的生产慕萨莱思的方法制备获得慕萨莱思。
全文摘要本发明公开了一种发酵生产慕萨莱思的高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCCNo.7513和利用此菌株发酵制备方法获得慕萨莱思。本发明通过不同温度、糖度、酒度及低氮耐受性分析、起发性测定、产酒力、絮凝性、自溶性、产H2S能力、产生物胺特性的检测、果胶酶活性测定和β-葡萄糖苷酶活性测定试验，筛选出酿酒性能优良的高温慕萨莱思酵母一株，广泛应用于轻工业生产等领域。
文档编号C12R1/865GK103243037SQ20131019738
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月24日 优先权日2013年5月24日
发明者朱丽霞, 薛菊兰, 冯姝, 郭东起, 王丽玲, 杨保求, 熊素英, 许倩, 陈胜惠子, 范英阁, 侯旭杰 申请人:塔里木大学
