免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
一 免疫组化（LP 法）操作步骤
1． 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行
⒉ 缓冲液洗 3min/2 次。
⒊ 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。
⒋ 缓冲液洗 5min/2 次。
⒌ 滴加 Ultra V Block ， 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。
（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。）
⒍ 缓冲液洗 5min/2 次。
⒎ 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）
⒏ 缓冲液洗 5min/2 次。
9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer（增强子），在室温下孵育 20 分钟。
10 ．缓冲液洗 5min/2 次。
11 ．滴加 HRP Polymer（酶标二抗） ，在室温下孵育 30 分钟。
（注：HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。）
12 ．缓冲液洗 5min/2 次。
13 ．向 1ml DAB Plus Substrate （或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen），混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。（具体时间由染色深浅决定。）
14 ．自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
二．免疫组化操作步骤
⑴、石蜡切片脱蜡至水。
⑵、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
⑶、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。
⑷、 5-10% 正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。
⑸、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
⑹、滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。
⑺、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
⑻、滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。
⑼、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
⑽、显色剂显色 3-15 分钟（DAB 或 NBT/BCIP）
⑾、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
三. 免疫组化染色步骤
冰冻切片 4-8um ，室温放置 30 分钟后，入 4 ℃丙酮固定 10分钟，PBS洗，5分钟x3，用过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
从实验结果而言，免疫组化技术服务主要涉及抗体实验结果的描述与分析，图片的确定与选取，相关数据的提供，上述工作是免疫组化工作的重点内容，只有严格的实验设计，标准的实验操作，专业化的结果分析才能更好的满足客户的要求，这点对于形式为腹水，上清，培养液之类的抗体显得更为重要。关于上述服务内容应该在实验开始前由双方明确，一般而言，客户方实验前应提出需要什么样的结果与分析，例如是简要还是详细的描述实验结果，需要实验数据否，图片的数量与规格等。如果为双盲试验或有第三方参与，则事先申明。
近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难肿瘤得到了明确诊断。在常规肿瘤病理诊断中，5%-10%的病例单靠H.E.染色难以作出明确的形态学诊断。尤其是免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时，准确率可达50%-75%。
免疫组织化学的临床应用主要包括以下几方面：
⑴恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断；
⑵确定转移性恶性肿瘤的原发部位；
⑶对某类肿瘤进行进一步的病理分型；
⑷软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的；
⑸发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定。
⑹为临床提供治疗方案的选择。
免疫组化的镜检在镜检前可以通过相关资料查询抗体的表达部位：细胞间质、细胞膜、细胞浆、核膜、细胞核以及在其中的多个部位表达（如：MPO抗体表达在细胞膜、细胞浆、核膜、细胞核上）和表达组织（如：VWF抗体在血管壁上表达，呈现环形）。
在显微镜下观察时，先在4倍镜下查找组织及其范围，然后查看整个组织确定阳性产物的表达部位，然后把阳性产物表达部位置于视野正中央，换高倍镜观察。
细胞凋亡检测的镜检细胞凋亡原理：正常凋亡细胞通过检测凋亡细胞DNA片段进行染色，正常的、人为造成凋亡的细胞很少能够被染色。以甲基氯复染，便于从形态学上分辨评估正常细胞和凋亡细胞。
首先确定目标凋亡细胞的组织部位（如眼球组织，由于玻璃体结构内没有细胞核，因此看不到凋亡，在整个组织的最外面有单层视网膜细胞，因此只能在最边缘查看凋亡细胞的阳性产物）
关于掉片HE、Masson、番红O、Nissl、Mallory等染色方法很少有掉片现象；免疫组化和细胞凋亡检测我们采用专门购买的防脱片，由于整个实验流程比较长，在实验过程中产生掉片是很正常的现象。对于容易掉片的组织，如：骨组织、脑组织、皮肤组织等掉片有时候是不可避免的。
联系客服
