在肿瘤免疫治疗系列的上一篇结尾，我介绍了Robert Schreiber等人从肿瘤微环境视角提出的“免疫编辑”（immunoediting）假说。该假说将免疫系统与肿瘤细胞之间的相互动态作用分为三个阶段：免疫清除（elimination）、免疫平衡（equilibrium）和免疫逃逸（escape）。当发展至免疫逃逸时，肿瘤组织已生长到临床影像学可见的程度，并通过“免疫雕刻”（immunologically sculpted）过程建立起具有免疫抑制性的微环境。分析肿瘤的免疫逃逸机制可以帮助临床医生制定更灵活有效的联合治疗策略。然而，肿瘤微环境异常复杂，需要整合多种分析技术才能掌握全面的信息。今天，我就以本系列开篇讲解的肿瘤免疫周期（thecancer-immunity cycle）为线索，与读者共同探讨肿瘤微环境中的各种已知的逃逸机制以及相应的分析策略，希望能为您的临床研究带来一些启发。
本期文章是肿瘤免疫治疗系列刊载的第三篇，本系列的主题依次是：
一、肿瘤免疫周期和相关临床药物机制
二、肿瘤免疫学的理论发展和分析策略
三、CAR-T细胞治疗和免疫检查点药物
BMS在本月初向CFDA药品审评中心提交Opdivo的上市申请并获得承办受理，相信以免疫检查点药物和CAR-T治疗为代表的免疫治疗会在2018年加速渗透肿瘤临床市场。本系列的第四篇将于12月年继续在基因智慧首发，敬请期待！
肿瘤微环境可被比作一个以细胞为单元的微观生态系统。这种生态虽小，但并不比宏观生态系统（如热带雨林和非洲草原）更容易研究，因为每一例肿瘤活检样本中的细胞类型、比例、位置、状态和相互作用都具有独特性。理解肿瘤细胞在微环境里如何与其他细胞互动并形成免疫逃逸状态，是未来肿瘤研究和药物开发的一个重要方向。为了简化讨论，我将从肿瘤免疫周期（详见本系列第一篇）出发，着重分析肿瘤微环境中可能发生免疫逃逸的3个环节：
一、树突状细胞提呈肿瘤抗原后进入淋巴结；
二、激活的T细胞穿过血管壁浸润到肿瘤微环境；
三、识别到肿瘤细胞后，T细胞增殖并溶解肿瘤细胞。
当以上任一环节受到肿瘤微环境的抑制，宿主免疫系统对肿瘤细胞的清除都会受到严重影响（图1）。根据“免疫雕刻”的概念，这种免疫抑制性微环境并非肿瘤细胞能够独自建立的，而是从肿瘤细胞与周遭环境的相互拮抗和斗争中逐步演化而来的。所以，临床获得的肿瘤活检组织中，肿瘤细胞和肿瘤微环境既相互依存，又相互促进。今天的文章将先讨论第一个环节，关于后两个环节的讨论将在刊载在本系列的后续文章中。
图1. 肿瘤微环境中存在各种机制来阻隔T细胞浸润和抑制其杀伤作用
一、树突状细胞提呈肿瘤抗原后进入淋巴结
人体的大部分体细胞会表达MHC I（主要组织相容性复合体）抗原呈递分子，它具有协调特异性免疫和非特异性免疫的重要作用。在正常情况下，MHC I呈递分子会忠实地在细胞表面展示细胞内部存在的很多蛋白质片段，T细胞会识别出其中的“异己”片段，并清除掉展示了“异己“片段的细胞，这也是特异性免疫和肿瘤免疫治疗的基础。然而，肿瘤细胞也是由正常细胞演变来的，其主要的抗原成分与正常细胞差别很小。如果不能精确选择“异己”标签，并平衡T细胞对肿瘤细胞的杀伤和对正常组织的耐受，就可能会引起严重的自免疫反应。所以，找到特异性高的肿瘤抗原并激活能够识别它的T细胞就成了肿瘤免疫学的一个重要的问题。具体分析时，有三个研究方向：1）肿瘤细胞具有多少（或哪些）可被宿主免疫系统识别的抗原；2）肿瘤细胞自身的呈递系统是否能够将这些抗原加工提呈；3）树突状细胞能否识别肿瘤抗原后分化成熟并进入淋巴结。
1. 解析肿瘤抗原
可被分子识别的肿瘤抗原根据来源分为6种：1）肿瘤病毒编码的蛋白（如HPV的E6和E7）；2）携带突变的驱动基因或抑癌基因（如EGFR和TP53）；3）组织特异性的分化抗原（如CD-19和Tyrosinase）；4）肿瘤睾丸抗原（cancertestis antigens，如NY-ESO-1）；5）异常高表达的基因（如HER-2）；6）转录或表达后被异常修饰的蛋白（如NA17和MUC-1）。对于已知的肿瘤抗原（如E6、HER-2和MUC-1等），通常在肿瘤组织切片上直接进行免疫组化（IHC）检测。IHC检测在肿瘤病理诊断和临床前药物研发中已经非常普遍。利用IHC分析已知肿瘤抗原的制约因素有：1）抗体探针的设计难，时间长；2）检测和分析通量较低；3）分析标准化和定量化难。针对后两点，可以分别通过组织芯片和数字病理软件一定程度解决，但抗体探针的设计难仍然是根本瓶颈。对于暂时缺少可靠抗体探针的目标肿瘤抗原，可以考虑使用RNA原位杂交技术进行检测。目前，美国的细胞治疗临床前研究中已经普遍采用如RNAscope这样的新型RNA原位杂交技术，寻找免疫生物标记物在微环境中的表达情况（下期将具体介绍）。
然而，上述的已知抗原多为异位表达或过量表达的正常人体蛋白质，免疫系统很难将其标记为“异己”（否则会有自免疫反应）。能够特异性激活免疫系统的一般是突变造成的肿瘤新抗原。现有的新抗原分析流程较为程序化但流程复杂。这种分析技术源于传统免疫学，目的是根据历史数据进行抗原表位（epitopes）分析，辅助疫苗设计和过敏原诊断。因为编码MHC抗原呈递分子的HLA基因簇（humanleukocyte antigen cluster）在人群中具有极高的多态性（图2），同一段抗原表位虽然能被个体A的细胞呈递到表面，但可能在个体B的体内就无法与呈递分子有效结合（本系列上篇中讲到的移植排异反应就是人群中MHC的多样性引起的）。已开发的肿瘤抗原应用主要服务个体化免疫治疗，包括为肿瘤个性化疫苗（见本系列第一篇）和过继细胞治疗提供合理药物设计的依据（图3）。
图2. 人体中HLA基因簇位于6号染色体，编码MHC I型和II型抗原呈递分子的基因被编码其他免疫功能蛋白的所谓“MHC III型基因”分隔开，图中深灰色标注的为假基因（pseudogenes），标注为浅灰色的是与免疫相关的其他基因，图片来自《Janeway’s Immunobiology》
图3. 使用全外显子组测序来分析肿瘤抗原可以提高过继细胞治疗（ACT）的有效率
分析肿瘤新抗原的策略是找到可能与患者的MHC 分子（主要是I型）结合的抗原表位后，合成出预测的抗原表位氨基酸序列，并通过体外T细胞激活实验验证新抗原的免疫原性（图4）。具体来讲，首先需要对患者的肿瘤样本和正常对照组织做全外显子组测序，利用生物信息算法对该患者的HLA基因进行分型并探测出存在突变的基因。随后，抗原表位预测软件（如NetMHCpan）将根据这些信息，通过对比电荷分布、表位结合力和可及性等特征来对潜在的肿瘤新抗原进行排序。接下来，利用新鲜肿瘤组织样本中获得的转录组信息，过滤掉排序较高但表达较低的肿瘤抗原（即不太可能有足够的量被T细胞识别到），得到初步的肿瘤新抗原预测列表。最后，合成部分置信度高的肿瘤新抗原，将其添加到从患者外周血分离出的树突状细胞、T细胞（或从外周血单核细胞诱导获得的T细胞）等免疫细胞中，通过酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测来验证预测出的新抗原能否激活宿主自身的免疫细胞。如果在细胞培养液中探测出T细胞分泌的干扰素γ （Interferon-γ），细胞培养皿中会观测到免疫斑点（图5），即表明合成的肿瘤抗原能够诱导树突状细胞成熟并激活肿瘤特异性的T细胞。
图4. 肿瘤新抗原的标准预测流程
图5. ELISPOT是ELISA检测的一种变体，灵敏度远超细胞染色或ELISA，其阳性结果显示的是免疫细胞群体中激活后分泌免疫球蛋白或细胞因子的细胞的比例（如右图）
需要强调的是，上述肿瘤新抗原分析中非常关键的一步是表位预测计算。该计算需大量调取免疫表位数据库IEDB（Immune Epitope Database）中表位结合力信息。IEDB数据库是美国NIH花费重金创造的世界最大的表位数据库，旨在服务于全世界的生物医学研究。从2003年起，IEDB不断收录来自病原微生物、过敏源及其他能够激发免疫系统的表位物质数据。新的数据生成策略势必会优化IEDB的数据质量，从而提升后期肿瘤新抗原验证效率。关于免疫表位的最新研究，推荐有兴趣的读者阅读CatherineWu在今年发表在Nature的文章《MassSpectrometry Profiling of HLA-Associated Peptidomes in Mono-allelic CellsEnables More Accurate Epitope Prediction》。
相较于复杂的个体化肿瘤抗原分析和验证，当下临床治疗熟悉的两个免疫治疗生物标记物，微卫星不稳定性（MSI/MMR）和肿瘤突变负载（TMB），在之前的几项研究中被认为是通过产生肿瘤新抗原而与CTLA-4和PD-1免疫检查点抑制剂的疗效存在联系。不过这之间的关联性并不像想象的那样显而易见。在一项利用小鼠结肠癌MC-38细胞模型开展的肿瘤抗原分析中，科学家发现只有约10%的非同义点突变产生的肽段可以与MHC I型分子有效结合，而这少部分抗原肽中的一小部分才能通过疫苗方式产生免疫原性（表明实验验证肿瘤抗原的必要性）。这可能是因为部分与MHC分子结合的表位序列上，由突变产生的氨基酸侧链并未指向T细胞受体（TCR）接触的方向，所以TCR无法区分该突变产生的抗原肽与正常肽段（图6）。此外，不同免疫表位引起的免疫原性反应也并不相同，说明单纯通过肿瘤抗原数目衡量肿瘤整体的免疫原性反应的做法，虽然比MSI和TMB更加可解释，但依然有可改进的空间。为了更准确地预测免疫系统可识别的肿瘤抗原，需要免疫学家进一步研究免疫原性的决定因素。
图6. 由于TCR与MHC I结合时只能接触到抗原表位的一侧，不是所有可以结合MHC I分子的肿瘤抗原表位都会产生免疫原性，右图是 MHC I-抗原肽-TCR三元体的空间结构图，TCR在上，MHC I分子在下，中间黄色的横条是抗原肽
2. 分析抗原呈递
如果肿瘤细胞持续表达并呈递上述具有免疫原性的抗原肽，可能会提高自身被免疫系统探测到并清除的风险。在正常的体细胞内，MHC I型分子负责结合潜在抗原（被水解的DRiPs），并将其呈递到细胞膜表面，等待被 T细胞检查（详见本系列第一篇）。目前，可以通过对肿瘤组织切片进行针对MHC I型分子的IHC检测（或对编码MHC I型分子的HLA-A/B/C进行mRNA定量检测）来分析抗原呈递功能的缺陷。一般的免疫反应中，细胞因子会刺激体细胞增强抗原呈递相关分子的表达量，提高抗原肽的暴露。然而在不同癌种中，科学家已发现有30-80%的肿瘤细胞表面出现了MHC I型分子的表达下降或缺失，而且下降的程度与肿瘤的恶化程度呈正相关。从人类蛋白图谱（Human Protein Atlas，HPA）数据库中，可以查询到各个癌种中不同HLA的表达数据及相应的患者生存期信息（图7、8）。
图7. HLA-B蛋白表达量阳性（左图）和阴性（右图）的检测结果，来自HPA数据库编号为1910和2083的两位女性乳腺癌患者的样本
图8. HPA数据库中对卵巢癌患者的HLA-A mRNA量与生存期之间关系绘制的Kaplan-Meier图
肿瘤细胞中出现的MHC I抗原呈递障碍可分为可逆和不可逆两类。由肿瘤病毒和原癌基因引起的转录水平或表观遗传水平上的抗原呈递异常通常是可逆的，而由HLA-A/B/C和β2 microglobulin（图9）等基因的结构缺陷或缺失导致的抗原呈递异常往往是不可逆的。除了MHC I抗原呈递分子本身外，负责加工和提成抗原的蛋白质的功能异常也会阻碍MHC-抗原肽-TCR三元体的形成，影响肿瘤免疫应答的信号产生。
图9. 当呈递抗原肽的MHC分子与TCR结合时，T细胞的CD8或CD4分子也会与对应的MHC结合，稳定MHC-抗原肽（中间深红色）-TCR三元体，其中作为MHC I分子组成部分的β2 microglobulin是左下图中浅红色的分子，图片来自生物艺术家David Goodsell
肿瘤细胞在降低自身抗原呈递的同时，还可能通过表达非经典的HLA-I型分子来更进一步实现免疫逃逸。在上面图2中显示的人类HLA基因簇中存在一个 HLA-G基因，它编码的蛋白是存在于母胎界面的一种免疫耐受分子，能够在胎儿发育阶段抑制母体的T细胞和NK细胞的细胞杀伤性，同时抑制树突状细胞的成熟和抗原呈递。HLA-G很少在健康组织中被检测到，但已有报道发现其在包括黑色素瘤、脑胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌等癌种中出现高表达情况，这可能与肿瘤维持长期的免疫逃逸有关。
有意思的是，多项结直肠癌的病理研究显示，HLA-A/B/C型分子高表达的肿瘤患者（呈递系统正常）预后好于低表达的患者，但HLA-A/B/C和HLA-G同时表达缺失的患者反而预后好于高表达的患者。这种现象在本系列第一篇中有涉及到，MHC I型复合体缺失的肿瘤组织在小鼠实验模型中也可以被部分清除。这种现象被怀疑是NK细胞杀伤的结果。已知在肿瘤组织中高表达的HLA-G可与NK细胞表面的杀伤细胞抑制受体（Killer-cell immunoglobulin-like receptor，KIR）结合，通过激活KIR的免疫受体酪氨酸抑制序列来抑制NK细胞杀伤性。所以，在人体免疫细胞识别“异己”的过程中，NK细胞填补通过T细胞留下的一个系统漏洞，即肿瘤通过MHC I表达缺失一次性完成免疫逃逸。其实不仅仅是NK细胞，巨噬细胞也存在这样的“补漏”功能。前天，在Nature上发表的最新研究报道，MHC I型分子中的β2 microglobulin模块可以通过与巨噬细胞表面的抑制性受体蛋白LILRB1结合（图10），向巨噬细胞传递“不要吃我”的安全信号（该研究中采用的流式细胞仪分析策略会在下两篇中讨论）。MHC I–LILRB1的信号传递此前在NK细胞中也有研究。这些研究从另一个角度解释了MHC I呈递分子表达完全缺失的患者为什么预后反而更好，因为非特异性免疫系统能够对“抵抗巡查”的细胞直接“开炮”。相信未来，科研人员会发现更多肿瘤细胞在抗原呈递上的缺陷，为临床治疗和药物研发带来全新的策略。
图10. LILRB1–β2M–HLA-A2蛋白复合体的晶体结构，蓝色模块MHC I分子中的β2microglobulin（β2M）模块通过与巨噬细胞的LILRB1抑制性受体结合，提供防止被巨噬细胞攻击的信号（请注意它在图9中为浅红色），图片来自原文《Engagementof MHC class I by the inhibitory receptor LILRB1 suppresses macrophages and isa target of cancer immunotherapy》
如果读者对利用HLA-I型分子表达来进行预后分析感兴趣，推荐阅读2014年的文章《Combined analysis of HLA class I, HLA-E and HLA-G predicts prognosis in colon cancerpatients》。对HLA-G的表达和多态性问题想了解更多的读者，推荐阅读2015年的文章《Balancing immunity and tolerance: genetic footprint of natural selection in thetranscriptional regulatory region of HLA-G》。
3. 分析树突状细胞
树突状细胞是诺贝尔奖得主Ralph Steinman于1973年发现的一种特化的抗原呈递细胞（详见本系列上一篇），负责摄取、加工和提成抗原后转移至淋巴结去激活淋巴细胞。在正常的肿瘤免疫周期中，被治疗手段杀死的肿瘤细胞会释放抗原到肿瘤微环境中，未成熟的树突状细胞不断从中提取可能的抗原肽。当形成MHC-抗原肽复合体后，在微环境中多种免疫原性信号的共同刺激下，树突状细胞会被激活并通过淋巴系统转移至区域淋巴结。在淋巴结中，树突状细胞与能够识别其所呈递的肿瘤抗原的T细胞结合，并表达共刺激分子B7协同诱导T细胞增殖和分化（详见本系列第一篇）。然而，肿瘤微环境中观察到的树突状细胞经常有抗原提呈或分化上的功能障碍。
据报道，在肿瘤微环境中浸润中，有80%以上的树突状细胞缺乏激活T细胞所必需的共刺激分子B7，影响肿瘤特异性免疫的启动。免疫微环境中有多重因素造成树突状细胞类似这样的功能异常。首先是混乱的信号因子影响。大多数肿瘤细胞和部分肿瘤间质细胞向微环境中释放血管内皮生长因子（VEGF），而VEGF会抑制树突状细胞的成熟和分化，阻碍了其向初始T细胞呈递抗原的功能，最终影响到T细胞的活化和扩增。除VEGF外，肿瘤微环境中的IL-10和GM-CSF也会干扰树突状细胞的抗原呈递功能。这些信号因子都可以通过单抗或RNA分子探针进行分析鉴定，确认肿瘤样本与正常组织间是否存在显著差别。其次是受到代谢和生物化学的调控。例如，树突状细胞在缺氧的肿瘤微环境中会表达PD-L1并出现功能紊乱。除糖酵解外，树突状细胞的脂肪酸代谢调节也是一个重要的研究方向。随着对肿瘤微环境中树突状细胞功能异常的理解深入，出现了一些通过改善局部树突状细胞活性来提升微环境中的抗原提呈效率的治疗新思路。推荐读者阅读2016年在Nature上发表的一篇文章《Biomaterialsand emerging anticancer therapeutics: engineering the microenvironment》。与之前Provenge的体外激活不同，本文介绍了一种在肿瘤微环境中激活树突状细胞来强化抗原呈递效果的疫苗新疗法（图11）。
图11. 新型的疫苗思路：让可植入生物材料精确释放GM-CSF来募集宿主的树突状细胞，这些树突状细胞会被生物材料上的肿瘤抗原和死亡细胞释放的CpG信号激活
