自己做实验或者看文献的时候经常能碰上流式细胞仪或者流式的图片。目前流式细胞术广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达特征的分析，界定不同种类的细胞群，测定分离出的亚类纯度，分析细胞的大小和总量，它可以同时分析单个细胞的多个参数。它主要用于检测标记在抗体上的荧光强度，这些荧光抗体则可以检测与其有特异性结合的分子，如T细胞表面TCR受体等。下面给大家普及一下流式相关的一些知识点。
（图片来自网络）
流式细胞仪的原理（Fluorescence Activated Cell Sorter，FACS）
流式细胞仪的原理：是在一组混合的细胞群中，加入针对特定分子的荧光单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，成为荧光抗体标记的靶细胞，当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。
在流式细胞仪分离装置中，不同的细胞亚群由于标记着不同的荧光抗体而带有不同的物理（颗粒度，密度，荧光强度）信息，从而将目的细胞从混合的细胞群中分拣出来。
流式使用三大步骤：
1-单细胞悬液的制作
2-相关分子的染色
3-上机分析
流式适合检测的样本类型：单细胞悬液
外周血、骨髓，灌洗液、体腔积液，培养的细胞系等
如果是脾脏，肝脏等实体器官，则首先得剪碎，消化，制成单细胞悬液再进行下一步实验。
流式染色的步骤包括：
将培养的细胞或组织样品制成单细胞悬液，然后将细胞放入流式管或者EP管中与荧光标记或未标记的抗体孵育（根据抗体的不同，分冰上孵育，常温孵育，37°孵育等几种方式，具体看抗体说明）。之后将细胞放入流式细胞仪中进行分析。
常见的染色方法：直接染色（直标法），间接染色（间标法）
直接染色：
直接染色时，细胞与直接结合有荧光染料（如FITC标记）的抗体孵育。它的优点在于只需要抗体孵育这一个步骤，从而消除了来自二抗的非特异性结合的可能性。
间接染色：
间接染色时，不带荧光的一抗识别靶分子，带荧光的二抗识别一抗，从而达到检测靶分子的目的。另外可选择使用亲和-生物素系统，即抗体与生物素结合并且通过荧光染料标记的亲和素来检测。
选择荧光结合染料
实验室最常见的荧光有 FITC，PE，PE-Cy7，Percp-cy5，APC，APC-cy7等。
不同的荧光染料的亮度有强有弱，强弱的相对差异取决于你的仪器，这是因为在不同的仪器上激光和过滤器的组合差异。不同的仪器检测的荧光通道稍有不同，所以染色之前一定要先查好你要用的仪器适合检测的荧光染料。
使用流式该注意的事项：
尽可能的制成单细胞悬液，减少细胞黏连
尽可能的让细胞保持活性状态，这样既可以减少非特异性染色，也可以继续进行后续的实验。
封闭Fc抗原
孵育时间不能多长或过短：过长了，非特异性染色增多，过短了染色不充分，荧光太弱，影响上流式
如果要染两种以上的分子，抗体带的荧光不能相同，不然上流式后没办法区分这两种分子
选荧光时尽可能的选择互相串色和补偿容易调的两种荧光，比如 FITC 跟APC可以一起用，APC 跟PE 也可以一起用，补偿和电压调起来很舒服
注意抗体使用和保存温度：4° OR 37°
流式常见问题及解决方法：
无信号/荧光强度弱
可能这种分子表达真的很低或者没有
可能是抗体不好用，或者荧光跟检测通道不匹配：换抗体
没有足够的抗体来检测：增加抗体的量
不正确的电压和补偿：调整电压和补偿
无法接近细胞内目标：如胞内染色时破膜通透不充分
细胞内染色结合荧光分子太大
激光器未对齐：机器本身的问题，请联系工程师
可溶性或分泌型目标蛋白？目标不同，染色方法不太一样
荧光分子的荧光逐渐消退：抗体放置时间太久，荧光已经淬灭
一抗和二抗不匹配
荧光强度过高
抗体浓度过高：减少抗体的量
过量抗体被困：胞内染色会出现的问题
封闭不足
电压和补偿调的太高
背景高或阳性细胞百分比高
增益设置过高或补偿过低
抗体过量
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