胎儿胎盘嵌合对胎儿游离DNA检测的影响：一个常见的生物学现象

　　背景

　　胎儿非整倍体的无创产前检测是一项重要的技术进步，临床医师在提供检测前咨询时，应当告知cfDNA的结果与超声检查和/或胎儿实际的染色体构成不一致的情况。由于cfDNA检测的是胎盘来源的核酸，因此会遇到传统血清学筛查不常遇到的问题。本文的目的是在cfDNA检测的新时代，解释胎盘遗传学，以便在检测前解释其优势与局限性，并在筛查结果与“事实”不符的情况下对检测后咨询提供帮助。

　　cfDNA检测的基础与胎盘绒毛的生物学

　　cfDNA检测的DNA片段来自胎盘绒毛外层凋亡的滋养层细胞，检测目的是发现21、18和13三体。最近一项Meta分析显示，cfDNA对于胎儿非整倍体检出具有很高的敏感性、特异性。单胎妊娠中，各目标染色体的复合检出率及假阳性率(FPR)分别为： T21(99.2% ， 0.09%), T18(96.3% ，0.13%), T13(91.0%，0.13%)，45,XO(90.3%，0.23%), 其他性染色体(93%，0.14%)。双胎妊娠中T21的检出率和FPR为93.7%、0.23%。这项Meta分析包括的37个研究具有很大的异质性，但各研究都有假阳性和假阴性的情况存在。

　　除了技术原因，造成检测结果与胎儿染色体构成不一致的生物学原因或者来自母亲，或者来自胎儿。胎儿因素包括胎儿部分比例不足、胎儿胎盘嵌合体及双胎之一消失;母体因素包括母体本身染色体异常、母体恶性肿瘤。移植男性器官、组织可能造成胎儿性别检测的错误。由于cfDNA检测的是母体与胎儿胎盘的混合DNA，因此胎儿胎盘构成不一致使得cfDNA只能成为筛查而不是诊断方法。

　　1983年BrunoBrambati和Giuseppe Simoni教授在米兰进行了世界上首例成功的绒毛染色体核型分析。当时认为胎盘的染色体组成忠实地反映了真正的胎儿染色体核型。而不久之后，科学家们遇到了一个新的生物学现象：染色体嵌合体造成的胎儿胎盘不一致。嵌合核型中的三体可能是合子形成后有丝分裂过程中发生了“不分离”错误，也可能是I期或II期减数分裂时发生了“不分离”，合子形成后纠正这一错误造成的。根据“不分离”错误发生的时间和机制，异常细胞系可以同时存在于胎盘和胎儿，也可以仅存在于胎儿或仅存在于胎盘。在前两种情况中，胎儿为真正的嵌合体(TFM)，通过羊膜腔穿刺可证实;第三种情况即为限制性胎盘嵌合体(CPM)，需要通过胎盘细胞遗传学分析证实。

　　绒毛染色体核型分析的金标准包括对细胞滋养细胞及间质核心的核型分析。通过这种分析方法，绒毛的嵌合可以分为3种：1型, 染色体异常只存在于细胞滋养细胞;2型，染色体异常局限于绒毛的间质核心;3型，染色体异常在两种成分中都能看到。当绒毛核型分析提示为嵌合体的时候，必须通过对羊水细胞的核型分析区分CPM和TFM。

　　一项对于1001个嵌合胎盘的研究有两个主要发现：首先， TFM和CPM在常见非整倍体中的发生频率具有染色体特异性。当绒毛存在嵌合时，胎儿受累的可能性取决于多个因素，包括异常细胞系分布的类型(1、2、3型)和方式(异常嵌合或异常非嵌合)、受累的染色体及染色体异常的类型。例如，2和7-三体是最常见的绒毛嵌合染色体，但羊水细胞都正常。T13在绒毛嵌合中较少见，胎儿受累比例为2.4%，而T21绒毛嵌合时胎儿受累比例达34%。然而，当T21与小的额外标记染色体以3型在绒毛中分布时，胎儿受累的比例为100%。其次，细胞滋养细胞的核型并不总与胎儿相符。大约1%的产前病例中，细胞滋养细胞含有正常细胞系，而胎儿不正常，反之亦然。这可以造成cfDNA的假阴性和假阳性结果。假阴性的风险为：T13 1/136、T18 1/64、T21 1/135、45,XO1/14。假阳性的风险取决于细胞滋养细胞嵌合的水平以及检测方法对低比例嵌合体的灵敏度。目前，将30%作为可检测出的嵌合比例切割值时，估计FPR为：T13 1/3754、T18 1/7472、T21 1/7372、45,XO 1/1421。由于假阴性和假阳性的存在，后续的产前诊断非常重要。

　　羊水细胞染色体核型是诊断的金标准，但由于cfDNA检测主要在早孕期施行(≥9-10周)，而羊水穿刺至少要在孕15周以后进行，等待过程中会有一部分孕妇因恐惧而选择未经验证就终止妊娠。由于常见非整倍体的胎儿胎盘差异对于不同染色体发生频率不同，cfDNA高风险后如果实施绒毛活检(CVS)，那么绒毛细胞嵌合的风险也存在染色体特异性，需要后续羊膜腔穿刺证实。cfDNA高风险后绒毛嵌合的风险为：T21 2%、T18 4%、T13 22%、45,XO59%。这些风险是通过前瞻性收集绒毛核型后，回顾性分析得出的。虽然随访不足，但这是目前仅有的数据。这项研究还发现，对于cfDNA T21和T18高风险的病例来说，选择CVS作为诊断手段是合理的，因为绒毛嵌合的风险与胎儿嵌合的风险相似或略高(~2%)。如果cfDNA提示45,XO高风险，由于绒毛嵌合的比例高，因此要选择中孕期羊膜腔穿刺。T13高风险也应选择羊膜腔穿刺，特别是在超声没有异常发现的情况下。如果超声检查发现畸形，无论cf DNA结果如何，即便CVS存在嵌合风险，也应选择CVS，以便尽早诊断。实际临床工作中，如果cf DNA高风险的孕妇选择CVS作为产前诊断手段，需要同时分析细胞滋养细胞和间质核心，以获得胎儿是否受累的最准确的风险评估。

　　由于母亲不带有Y染色体，因此认为通过检测Y染色体特异性序列，无创检测可以准确的诊断出男性胎儿患者(例如严重的X连锁疾病)。但cfDNA检测出的胎儿性别有时会与超声检查和/或产前诊断的结果不一致。除了实验室取样错误和质控因素，可能的原因包括胎盘组织的分布不均、“容易混淆”的基因型。例如，超声看到的外生殖器与核型提示男胎，cfDNA提示女性胎儿，要怀疑胎儿DNA部分不足，或者双胎之一45,X停止发育。男胎妊娠中胎盘存在45,X的比例约为1/24000。而当超声和核型分析显示为女性胎儿，cfDNA提示男胎时，要怀疑胎盘中有男性细胞系嵌合、双胎之男胎停育、母亲异体输血或移植。不过，如果超声看到的外生殖器与核型及cfDNA结果不符，就要考虑性发育疾病。例如超声显示为女性胎儿，cfDNA和核型分析显示男性，要考虑46，XY胎儿女性化疾病(如Smith-Lemli-Opitz综合征，发病率1/20 000-1/40 000;雄激素受体缺乏，发病率在男性活产儿中占1/20000-1/64 000;5-α还原酶缺乏)。如果cfDNA检测和核型分析提示女性胎儿，而超声显示男性，要考虑46,XX胎儿男性化疾病(如有一段隐藏的SRY序列，外源性雄激素，先天性肾上腺皮质增生，分泌雄激素的肿瘤)。

　　通过cfDNA检测胎儿拷贝数变异(CNV)是最近一个有趣的讨论话题。对于CNV的检测有两种类型：(1)对已知遗传综合征特定目标区域致病性CNV的检测包，大小为1.5到30Mb;(2)全基因组CNV，大小在7～10Mb以上。大体结构正常、核型正常的胎儿中有1.7%存在CNV，与母体年龄无关，因此CNV是胎儿结构正常的年轻孕妇存在胎儿染色体畸形的主要危险因素。

　　作者观点

　　胎儿胎盘嵌合是cfDNA检测结果与实际情况不符的主要生物学原因之一，性染色体的嵌合比例更高，同一胎盘中可以同时存在46,XX/47,XXX/45,X三种细胞系。而对于CNV，人群中广泛筛查存在着局限性和缺点。对于CNV胎儿胎盘不一致的数据很有限。绒毛中结构重排嵌合的发生率为0.4%(243/60347)，在那些累及细胞滋养细胞的病例中(1型、3型嵌合)，胎儿累及率为19%(21/110)。其中47+标记染色体、不平衡重排和平衡重排的胎儿受累率分别为41.2%(14/34), 10.6%(7/66)和0%(0/10)。很难确定通过cfDNA进行全基因组CNV检测会有多少假阳性的病例，但一定会占相当比例。另有一些绒毛嵌合只累及间质核心，47+标记染色体、不平衡重排和平衡重排的TFM分别占25.8%(8/31)、7.9%(6/76)、19.2%(5/26)。而不累及细胞滋养细胞的TFM在cfDNA检测时会呈现假阴性。根据粗略和保守估计，如果考虑不平衡重排，8%表面平衡的重排和13%的47+标记染色体因标记染色体存在常染色质序列而有不良结局，因此不累及细胞滋养细胞的TFM造成的假阴性约为2.4%。

　　此外还有其他问题。首先，有一项对175000个高危妊娠进行CNV-cfDNA筛查的研究，但在普通人群中缺乏验证。一些回顾性研究选择的样本是已经知道结局的，但无法准确计算检出率与FPR，因为部分病例检测了核型，但是没有CMA结果。其次，cfDNA用于CNV的临床意义有限。致病性CNV的检测包只能检测所有致病性CNV的10%，而7～10Mb的CNV检测能发现20～30%，胎儿仍然有很大的残余风险。并且，如果CNV片段较大，超声上往往会有异常表现。第三，筛查的阳性预测值低。如果进行全基因组CNV的cfDNA检测，有三个原因可能造成假阳性：(1)片段化的基因组可能导致CNV的无限联合;(2)大约3.4%的胎儿CMA结果意义不明，这些临床意义不明确(VOUS)的CNV使遗传咨询和做决定更加困难，cfDNA用于CNV筛查会增加不必要的有创检查;(3)母亲的恶性肿瘤可能导致假阳性结果。

　　从胚胎发育学上来看，孕11周之前进行cfDNA检测的临床价值很有限。这个孕周“自然选择”在起作用，全面的超声能够发现问题，而孕妇可能过于看重cfDNA的阴性结果而忽略了超声对其他染色体的价值。此外，羊水检查要孕15周后进行，等待中的焦虑情绪也是一个问题。在血清学筛查后进行cfDNA检测的策略里，加快报告时间才是有意义的。

　　总结与展望

　　随着对胎盘生物学的复杂性和飞速发展的分子诊断技术的不断认识，需要向孕妇提供更为全面和详细的产前遗传咨询，充分筛查、诊断以及cfDNA检测的优点和局限性。

　　产前cfDNA检测应用的“质量”应当重于“数量”。重点应在：(1)检测流程的简单化、自动化和标准化，降低费用并改善质量;(2)开展有统计学意义的临床前瞻性验证研究;(3)提高cfDNA检测的准确性，包括提交每一份样本的胎儿DNA比例、建立确定胎儿比例的金标准，以及对胎儿比例<>

　　文献引自：F.R.Grati.Implicationsof fetoplacental mosaicism on cell-free DNA testing: a review of a common biologicalphenomenon. Ultrasound Obstet Gynecol 2016; 48:415-423.