摘要：以新抗原为靶点的T细胞过继细胞治疗(ACT)可介导转移癌患者的持久反应，但对上皮癌共同抗原的细胞疗法还没有广泛应用。在本文中，作者报告了一个病人的T细胞受体(TCRs)识别突变p53 p.R175H的特征，该基因在癌症患者中共享，并鉴定了突变的p53 p.R175H的HLA-A * 0201限制性识别，其最小肽表位是HMTEVVRHC。采用四聚体分选法分离反应性T细胞，鉴定出3个TCRs。这些TCRs介导了对内源性表达p53 p.R175H和HLA-A*0201的癌症细胞株的识别，并证明只有同时表达p53 p.R175H和HLA-A*0201的情况下才能识别。这项研究表明，常见的共享突变表位（如p53中发现的表位）可引起免疫原性反应，并且ACT的应用可扩展到任何同时表达HLA-A*0201和p53 p.R175H突变的癌症组织学患者。
患者及治疗特点：一名36岁的女性在NCI手术科就诊，诊断晚期结直肠癌（KRAS野生型，微卫星稳定），伴有双侧肺，肝和淋巴结转移。通过用卡培他滨，奥沙利铂和贝伐单抗治疗，疾病已证实进展。根据NCI IRB批准的组织采集方案，通过视频辅助胸腔镜手术切除肺转移瘤（肿瘤4196-1,4196-2）以产生TIL和遗传分析。在鉴定突变反应性淋巴细胞培养物后，她参加了NCI IRB批准的I / II期方案10-C-0166，其目的是评估晚期胃肠道癌患者自体体外扩增TIL过继转移的安全性和有效性。治疗包括非清髓性淋巴耗竭化疗（环磷酰胺和氟达拉滨）、细胞输注前两天单剂量的pembrolizumab、选择的自体TILl输注和每隔3周额外给药的三剂pembrolizumab。治疗后，切除一个新发现的肾上腺转移瘤（肿瘤4249）进行进一步评估。
图文Figure 1 Identification of mutation-reactive T cells from tumor-infiltrating lymphocytes (TIL)
图1 TIL中突变反应性T细胞的鉴定。
A：用TMG转染的和肽脉冲的自体DC共培养后，41BB +细胞的TIL片段筛选的代表性图。
B：片段14与TMG转染的自体树突状细胞共培养后的IFNy ELISPOT。
来自患者4196的两个肺转移的WES产生171个非同义突变用于评估。将这些突变编码到11个TMG(串联微基因)上，每个TMG中具有16个小基因。还合成了编码每种突变的25-mer肽用于筛选。使用18个肽来产生每个肽库(PP)，总共10个PP。从24个肿瘤片段中提取淋巴细胞，以筛选出对所有患者新表位的TMGs和PPs的反应性。这证实了片段14对TMGs1、片段20对肽池2和片段22对肽池6的反应性。
C：将片段14TIL与自体DC共培养，用编码TMG1上每个突变的单个肽（41BB％，IFNγ）脉冲。
D：片段14 TIL对HPLC纯化的p53肽的反应活性。
单独的肽测试发现片段14中的CD8+T细胞与p53 p.R175H反应。
补充图2:片段20中的CD4+T细胞与 GTF2E1 p.S334F反应，而片段22中的CD8+T细胞与ARMCX5-GPRASP2p.G722W反应，
总结：根据这些结果，选择片段14、20和22进行扩展，并按照机构方案纳入患者的TIL治疗中 (Rx1 TIL)。
Figure 2 Treatment of apatient with metastatic colon cancer with TILs.
肿瘤浸润淋巴细胞治疗1例转移性结肠癌
A:转移性结肠癌患者先接受一针pembrolizumab，随后输注91.8*10^9细胞。输注后的呼吸窘迫暂停了常规的高剂量IL2的细胞后给药。对症处理后好转，于第8天出院。
在第一次方案评估时（TIL后6周），根据Recist标准，她的靶病变减少了11%，非靶向肝病灶和主动脉腔淋巴结病灶也一并缩小。
在她的第二次方案评估中(TIL后12周)，她的靶区和靶外病变的大小继续减小。然而，CT在评估中发现了一个新的孤立的左肾上腺肿块，表明进展。此肾上腺肿块继续生长，经腹腔镜切除。期间共接受了4次K药，q3w。
B:用HLA等位基因读数来估计4249例(随后切除的肾上腺病变)HLA等位基因的相对频率。正常预期频率为0.50。对切除的肺肿瘤（4196）和肾上腺肿瘤（4249）的染色体拷贝数分析表明，已知编码HLA等位基因的6号染色体部分杂合性缺失（LOH）发生了进化。患者的肾上腺肿块没有A*0201等位基因。肾上腺肿瘤也有X染色体的LOH，这导致了ARMCX5-GPRASP2基因丢失。说明新病灶的出现与LOH有关。
转归:7个月后，患者出现大肠梗阻及进一步进展性疾病，伴有新的双侧肺病变、腹膜癌和腹水。她被停止研究并转介接受全身化疗。
Figure3 Isolation and characterization of A*0201-restricted TP53 TCR.
图3 A*0201限制性TP53 TCR的分离与表征
A:在鉴定TIL对突变的p53的反应性后，研究人员试图表征HLA限制和T细胞识别所需的最小表位。为了评估HLA的限制，将患者的TIL与COS7细胞共培养，用与患者的每个I类HLA等位基因以及编码突变体TP53的TMG相对应的DNA质粒转染COS7细胞。
发现：只有当突变的TP53由HLA-A*0201转染的COS7细胞呈现时，患者的TIL才具有反应性。说明突变受HLA-A*0201限制！
B:基于突变受HLA-A*0201限制的证据，利用在线开放源netmhc4.0预测9mer、10mer和11mer候选最小表位进行评价。研究人员选择了5个含有突变氨基酸的候选肽进行评价，这些突变氨基酸具有最高的预测结合亲和力。
然而结果却发现：没有预测表位以高亲和力（<50nmol / L）与HLA-A * 0201结合。这可能是由于在前两个肽的C末端锚定位置处存在半胱氨酸残基(疏水性）。
C:将带有候选最小表位的T2细胞与TIL共培养用于治疗该患者(Rx1)。
发现：当呈递9mer HMTEVVRHC时，TIL产生最多IFNγ。
D:为了分离p53-反应性TCR，合成负载HMTEVVRHC的HLA-A * 0201四聚体并用于染色Rx1 TIL。将前5％染色细胞分选到96孔板中，并使用Fluidigm C1平台（Fluidigm）制备单细胞RNA-seq样品。使用Illumina MiSeq进行单细胞RNA-seq，随后使用内部软件鉴定配对的全长TCRα和TCRb链序列。使用该方法鉴定了四种可能的TCR。
结果：鉴定出三个独特的TCRb链，其中一个与两个可能的TCRa链配对，BV6-1占63.3%，BV11-2占25.8%，BV10-3占鉴定的所有生产序列的9.2%。（BV为TCRb链变异区，与抗原识别相关。）
E:将候选TCR质粒克隆到 p.MSGV1载体中，逆转录导入同种异体供者淋巴细胞。CD8+和CD4+分离的转导细胞与自体DCs共培养，随着突变p53肽浓度的降低而脉冲。
结果：三个受体对突变的p53肽在低至25 ng/ml的浓度下表现出突变特异性反应。
Figure 4 TCR-transduced cell recognition of p53 p.R175H tumors.
图4 TCR转导细胞对p53p.R175H肿瘤的识别
接着还评估了这些TCR转导的T细胞是否会识别内源性表达突变的p53的肿瘤细胞系。
A:研究人员将突变体TP53基因遗传地引入HLA-A * 0201 +骨肉瘤细胞系SAOS-2中，并评估表达三种TCR中的每一种的CD8 +和CD4 + T细胞群的识别。
B:研究组合了一组商业上可获得的细胞系，据报道含有突变体TP53基因，包括结肠腺癌（LS123; ATCC），乳腺癌（AU-565和SKBr3; ATCC），卵巢癌（TYKNU和TYKNU CpR;日本细胞银行），子宫癌（KLE;日本细胞库），骨髓瘤（KMS26;日本细胞库），原发性导管癌（HCC1395; ATCC），白血病（CEM / C1和CCRF-CEM; ATCC），平滑肌肉瘤（SKUT1; ATCC）和肺腺癌（VMRCLCD）。
结果：只有HLA-A2表达阳性并且表达FACS大于1,000拷贝的TP53 p.R175H的细胞系，才会被表达三种TCR的T细胞识别。
C:通过FACS（CCRF-CEM，LS123和AU565）测定的表达很少或不表达HLA-A2的三种细胞系用HLA-A * 0201逆转录病毒颗粒转导，并使用嘌呤霉素选择进行传代。将所有三个TCR转导的T细胞群与每个肿瘤细胞系共培养过夜并评估反应性。TCR转导的细胞识别所有三种A * 0201转导的肿瘤细胞系。
结果:TCR转导的T细胞识别内源性表达突变的p53的肿瘤细胞系。
讨论:研究人员描述了识别p53 p.R175H的三种HLA-A * 0201限制性TCR的鉴定和表征，从而证明突变的TP53可以是免疫原性抗原。虽然在单个热点位置（氨基酸位置175）证明了反应性，但这开启了TP53中的其他热点也可能引发免疫原性反应的可能性。研究结果证明，这些TCR可以在低肽浓度下和在由HLA-A * 0201限制性肿瘤系内源性呈递时表现出对靶表位的识别。后一个发现表明，在患者的PBL中以高频转导的现成的TCR可能是治疗肿瘤表达HLA-A*0201和TP53 P.R175H突变的一种有价值的试剂。结论值得推广。
然而，仍有几种因素似乎导致TIL治疗失败。首先，ACT中少于3％对p53具有反应性。其次HLA-限制性元件的丧失阻止了TIL识别靶标新抗原。再有转移性病变中TP53的潜在损失可能会排除这些病变的免疫原性识别。最后，虽然可以在TCR转导的细胞中操纵新抗原反应性细胞的数量，但是输注细胞的持久性可能影响细胞产物的功效和反应的持续时间。
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