在癌症治疗领域，免疫治疗被广泛应用且逐渐成为多种癌症治疗的重要组成部分。研究表明，癌症特异性突变抗原（又称为新抗原）在免疫治疗学科中起着关键作用，特别是在免疫检查点抑制和过继性T细胞治疗中。一些研究表明，高突变负荷与生存改善相关。因此，直接靶向新抗原成为一种重要策略，其中使用过继细胞疗法（ACT）是一种常用方法，通过扩增体外培养的T细胞并将其转移至患者体内。
肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的移植可以在某些常见上皮性癌症患者中引发持久的完全反应，但发生频率较低。要更好地理解T细胞对新抗原和肿瘤相关免疫逃避机制的反应，需要拥有同种异体肿瘤作为试剂。我们研究了从患有结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、胆管癌、食管癌、肺癌和肾癌的转移灶中获得的患者源性肿瘤器官样物（PDTO）满足这一需求的能力，并评估了它们作为选择用于移植细胞疗法的T细胞的工具的效用。对38次成功建立的PDTO进行了全外组测序（WES）以定义突变。然后，使用自体TIL或转导有克隆的T细胞受体识别特定新抗原的T细胞，评估了这些器官样物是否被识别。PDTO还用于识别和克隆与特定肿瘤相关的目标。47次尝试中，成功建立了38个PDTO。其中75%在2个月内获得，这个时间段适合用于筛选临床用途上的TIL。这些系列与它们的原始肿瘤具有良好的遗传稳定性，尤其是对于较高克隆性的突变。免疫学识别实验显示了在全体HLA免疫组织化学检测和某些新鲜肿瘤的全外组测序中未发现的HLA等位基因丧失。PDTO还可用于显示识别相同抗原的T细胞受体的差异，并查找和克隆识别私有新抗原的T细胞受体。PDTO可以检测阻碍T细胞识别的肿瘤特异性缺陷，并可能在选择用于移植细胞疗法的T细胞受体和TIL时发挥作用。
图文详解
图 1 对患者的6-11独立肿瘤样本（多个病灶和病灶内多个样本）进行WES 检测。在左侧的彩色编码热图上，每个发现的突变都以横线表示，并按其 "克隆性 "排列（在新鲜肿瘤中发现一次或两次的突变位于顶部，在所有样本中发现的突变位于底部）。在接下来的两栏中，则标注了该突变在类器官中的存在或不存在，以及其肿瘤片段的来源。维恩图(右图)比较了患者4402 (a)、4421 (b)和4424 (c)在类器官和原始肿瘤片段中的总体肿瘤突变负担。PDTO和原始肿瘤片段中的突变具有最高的克隆性，差异在于突变的克隆性最小
图 2 串联小基因表达的新抗原的TIL识别与自体患者源性肿瘤样器官的TIL识别的相关性。左侧标记的TIL片段培养物对表达肿瘤相关突变的串联小基因TMG1-6电穿孔的自体树突状细胞(不相关的TMG对照)或同种异体(对照)和自体PDTO靶细胞进行检测。TIL培养的PMA刺激为阳性对照。每个点旁边都有机器枚举的点号。选择突出显示的孔进行进一步研究。
图 3 a 将特异于 KRAS G12V 并受 A*11:01 限制的小鼠 TCR（在 HLA-A11 转基因小鼠中培养）逆转录转导到 A*11:01 阴性的供体 T 细胞上，并与 HLA-A11+/G12V+4424 和 4437 类器官共同培养。G12VTX4402 类器官和引入或未引入 G12V 的 K562-A11 分别作为阴性和阳性对照。添加突变肽，为检测HLA-A11的功能提供外源抗原。ELISA法检测IFN-γ分泌。
b 通过 LOHHLA 进行的 HLA-LOH 分析显示 4424 类器官中的 HLA-A*11:01 丢失。
c 通过 LOHHLA 进行的 HLA-LOH 分析显示 4437 类器官中的 HLA-A*11:01 减少。
d 通过 LOHHLA 对 4424 的新鲜肿瘤样本进行 HLA-LOH 分析。
e 通过 LOHHLA 对 4437 的新鲜肿瘤样本进行 HLA-LOH 分析。
图4将患者源性KRAS G12D特异性、C*08:02-限制性识别9mer肽的TCR (TCR #1)逆转录转导到C*08:02阴性供体T细胞上，并与4429和4430类器官以及其他表达KRAS G12D突变或不突变的C*08:02肿瘤细胞系共培养(A)。通过ELISA检测IFN-γ分泌。除非突变的肽被脉冲到其表面，否则对任何一个类器官的识别都是最小的。IFN-γ预处理没有显著提高TCR #1对两种类器官的识别(b)。将识别10mer肽的不同KRAS G12D C*08:02-限制性TCR (TCR #2)逆转录病毒转导到C*08:02阴性供体T细胞上，并与4429和4430类器官共培养(C)。用 ELISA 测量 IFN-γ 的分泌。除非将突变的肽脉冲到4429类器官表面，否则无法识别;而 4430类器官在没有额外肽的情况下很容易被识别。HLA-LOH分析表明HLA-C*08:02基因存在于4429 (d)和4430 (e)类器官中。
图5 a 将KRAS G12D特异性，HLA-A*11:01-限制性小鼠TCR(来自HLAA11转基因小鼠)逆转录到A*11:01-阴性供体T细胞上，并与HLAA11+类器官、G12D突变(4432)和不突变(TX4402，一种稳定由HLA-A11转导的乳腺癌类器官)以及与KRAS G12D共转导和不共转导的HLA-A11转导的K562共培养。ELISA法检测IFN-γ分泌。除非将突变的肽脉冲到4432类器官表面，否则无法识别。
b 通过 LOHHLA 进行的 HLA-LOH 分析表明，4432 有机体中存在 HLA-A*11:01 基因
图6 a 使用qRT PCR比较各种类器官和常规胰腺肿瘤系中突变KRAS G12D RNA的表达水平(与肌动蛋白B相比)，而不考虑HLA类型(PDTO 4425是野生型KRAS对照)。
b对于a中表达HLA-A11的5个肿瘤(PTDO 4432、Panc-1和A11转导的3个肿瘤系)，与表达KRAS G12D特异性A11限制性TCR的PBL共培养时，IFN-g的释放与KRAS G12D表达相关(R2 =0.9916, p < 0.0001)。
图7 图2中患者的TIL片段与自体PDTO以及用TMG电穿孔的树突状细胞共培养。
a片段培养与表达无关TMG、TMG2、TMG 1的DC或与自体和异体PDTO共培养的例子。对这些共培养物进行分拣，寻找上调 4-1BB 的 T 细胞，以富集反应性，并对这些细胞进行 TCR 测序，以鉴定高频个体化 TCR（iTCRs）。
b合成了11个候选iTCRs，并将其逆转录到PBL上，对类器官、TMG 1和TMG2进行了测试。流式细胞术检测CD3+ T细胞上调4-1BB的百分比。识别靶细胞的TCR以黄色突出显示。通过特异性识别突变型和野生型肽进一步确认的抗原身份被列为已确认的新抗原。
c HLA-LOH分析显示，PDTO中MHC - I类A、B和c等位基因的杂合性保持不变。
本研究提到了患者源性肿瘤类器官（PDTO）及其在免疫治疗中的潜力。然而，PDTO存在一些局限性，包括样本量小、受抽采样误差影响、难以找到对照组织等。此外，对PDTO识别与T细胞治疗的关系还需要进一步研究。三维类器官培养技术和新抗原反应性T细胞的发现可能有助于克服T细胞治疗的难题。
参考文献
Parikh AY, Masi R, Gasmi B, Hanada KI, Parkhurst M, Gartner J, Sindiri S, Prickett T, Robbins P, Zacharakis N, Beshiri M, Kelly K, Rosenberg SA, Yang JC. Using patient-derived tumor organoids from common epithelial cancers to analyze personalized T-cell responses to neoantigens. Cancer Immunol Immunother. 2023 Oct;72(10):3149-3162. doi: 10.1007/s00262-023-03476-6. Epub 2023 Jun 27. PMID: 37368077; PMCID: PMC10491521.
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