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Nrf2介导的HO-1激活是人参皂苷代谢物化合物K对ARPE-19人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤的阻断作用所必需的
摘要：
背景：化合物K（CK）对不同慢性疾病的有益作用已被证明至少与抗氧化作用有关。然而，由于其在人视网膜色素上皮（RPE）细胞中的抗氧化活性仍不清楚，在这里，我们研究了CK是否能减轻ARPE-19细胞中氧化应激刺激的损伤。
方法：通过细胞活力、DNA损伤和细胞凋亡试验，评价CK对过氧化氢（H2O2）处理的细胞的保护作用。采用荧光分析和免疫印迹法研究CK对活性氧（ROS）产生和线粒体功能障碍的抑制作用。
结果：CK可显著抑制ARPE-19细胞中H2O2促进的细胞毒性、氧化应激、DNA损伤、线粒体损伤和细胞凋亡。此外，核因子红样2相关因子2（Nrf2）的磷酸化水平及其向细胞核的穿梭水平增加，这与血红素加氧酶-1（HO-1）的激活上调有关。然而，HO-1的阻断剂锌原卟啉显著消除了CK对H2O2处理的ARPE-19细胞的保护作用。
结论：本研究表明，CK激活Nrf2/HO-1信号通路在挽救ARPE-19细胞免受细胞氧化性损伤中起着重要作用。
视网膜色素上皮细胞（RPE）由视网膜的光感受器和 脉络膜毛细血管层之间的单层细胞组成。它们形成一个外血-视网膜屏障来保护视网膜，并参与维持光感受器稳态。因此，RPE细胞在抑制视网膜水肿和新生血管形成中起着重要作用。由于形成视力耗氧量大，RPE细胞在富含活性氧（ROS）的氧化环境中不受保护。过度的氧化应激最终可诱导RPE细胞发生不可逆的变性和凋亡，导致年龄相关性黄斑变性（AMD）等各种眼疾的发生和发展。同时，多项研究表明，去除ROS可以有效防止RPE细胞的氧化损伤。在这种情况下，有必要预防RPE细胞的氧化应激，以保护和治疗眼科疾病。
人参皂苷是人参（人参）属植物中皂苷的次生代谢产物，被广泛应用于治疗各种疾病。已有证据表明它们对几种慢性疾病有多种有益的作用。许多先前的研究结果也表明，人参皂苷含有多种生理活性，如抗氧化和抗癌活性，但没有显示出任何明显的毒性。更重要的是，尽管活性氧的积累可以作为人参皂苷诱导癌细胞死亡的主要来源，它们对细胞损伤的保护作用与强大的抗氧化活性有关。此外，有报道称，人参皂苷可以通过激活核因子红样2相关因子2（Nrf2）作为有效的ROS清除剂，有效阻断氧化应激，Nrf2是抗氧化信号传导的有效介质。例如，人参皂苷Rg1拮抗脐静脉内皮细胞颗粒物质刺激的氧化条件，同时抑制ROS的产生，这与诱导血红素加氧酶-1（HO-1）的表达相关，HO-1是Nrf2的代表性下游靶点。他们的研究结果与Li等的研究结果非常一致，即Nrf2/HO-1轴的激活是Rg1抑制心肌细胞氧化损伤的作用所必需的。在顺铂诱导的肝脏和紫外线（UV）照射的小鼠皮肤损伤模型中，Nrf2的激活也与Rg1的抗氧化能力相关。此外，最近有研究表明，各种人参皂苷激活的Nrf2在氧化应激介导的神经退行性变、肝脏炎症、缺血性中风等其他疾病的防御机制中发挥了直接作用。与之前的研究结果相似，Yang等认为人参皂苷化合物K（CK）可以通过激活Nrf2信号通路来阻断神经元细胞的死亡。最近，有报道称，局部给予Rg1可以保护晶状体免受氧化应激引起的白内障，并通过消除ROS的产生来改善高血糖和缺氧诱导的RPE细胞损伤。同样，Rh3通过激活Nrf2信号通路阻断uv诱导的RPE细胞损伤，同时抑制ROS的生成。然而，关于CK在RPE细胞等眼部细胞中的抗氧化活性的研究尚未见报道。因此，在我们的研究中，我们研究了CK对过氧化氢（H2O2）促进的人ARPE-19细胞氧化损伤的预防潜力，以及Nrf2信号通路的激活是否在这一过程中起调控。
实验结果
1.CK减轻了H2O2诱导的细胞活力的降低
MTT实验结果显示，10 mM 以下CK刺激对ARPE-19细胞生长无明显抑制作用，而20 mM CK以上对细胞有明显抑制作用（图1A）。随着浓度的增加，过氧化氢刺激作用降低了细胞活力，500 mM过氧化氢刺激作用的细胞活力约为60%（图1B）。因此，为了避免细胞毒性，CK预处理浓度为10 mM以下，过氧化氢处理浓度为500 mM。为了探讨CK对过氧化氢抑制细胞生长的保护作用，在过氧化氢暴露24 h前，用CK预刺激细胞1h。如图1c所示，在CK的存在下，过氧化氢处理导致的细胞活力下降明显被抑制。
2.CK降低了H2O2促进的ROS生成
如图1d和E所示，流式细胞术结果显示，H2O2处理的细胞中ROS水平显著升高，而单独用CK刺激的细胞中的ROS水平与对照组细胞没有明显差异。而CK预处理后，随着CK浓度的增加，H2O2诱导的ROS生成逐渐减少。在H2O2处理后，CK对细胞中ROS积累的保护活性在DCF荧光图像中也很明显（图1F），这表明ck改善细胞活力与其抗氧化作用有关。
3.CK阻断了H2O2促进的DNA损伤和细胞凋亡
为了评估CK是否能保护过氧化氢诱导的DNA损伤，我们研究了p-γH2AX的水平。如图2A所示，在H2O2处理的细胞中，p-γH2AX水平显著升高，而在与CK共刺激条件下，其水平下调至对照水平。免疫荧光染色也显示了类似的结果，即经过氧化氢处理后，细胞核内的p-γH2AX的水平显著上调，但CK预处理后减弱（图2B）。此外，彗星实验结果表明，过氧化氢处理大大增加了DNA尾巴长度，但在CK存在的情况下，H2O2诱导的彗星尾形成明显得到缓解（图2C）。为了确定CK是否能保护细胞免受H2O2诱导的细胞凋亡，我们在annexin V-FITC/PI染色后进行了流式细胞术，发现过氧化氢处理显著增加了细胞凋亡诱导的频率，而CK预处理后可明显恢复（图2D和E）。
4.CK恢复了H2O2促进的线粒体功能障碍和caspase-3的激活
为了研究CK是否能改善H2O2诱导的线粒体功能障碍，我们使用JC-1对MMP进行了评估。如图3A所示，红色荧光，一种反映健康细胞线粒体基质中高水平MMP的JC- 1复合物的聚集形式，在对照组细胞中强烈表达。相比之下，在H2O2处理的细胞中，绿色荧光的强度增加，表明JC-1仍然保持在单体形式。然而，CK预处理逆转了JC-1聚集/单体比值，这意味着CK共处理阻断了H2O2诱导的线粒体功能障碍。此外，H2O2刺激细胞的胞质部分的细胞色素c蛋白水平高于线粒体部分，说明过氧化氢处理增加了细胞色素c向细胞质的释放（图3B）。过氧化氢处理后Bax的表达显著增加，而Bcl-2的表达显著降低，这与caspasease-3的活化和聚（ADP-ribose）聚合酶（PARP）的降解有关（图3C和D）。然而，这些改变在CK的存在下明显被抑制（图3）。
5.CK促进了Nrf2/HO-1信号通路的激活
接下来，我们研究了Nrf2激活在H2O2处理的细胞中CK抗氧化作用中的相关性。如图4a所示，与未处理的细胞相比，过氧化氢处理和CK单独处理的细胞中Nrf2蛋白水平略有上调。然而，在与CK共刺激的H2O2处理的细胞中，Nrf2及其磷酸化形式（pNrf2）的表达显著上调，它们主要表达在细胞核中表达（图4B），表明Nrf2被激活并移动到细胞核。此外，在与CK和过氧化氢共同刺激的细胞中，细胞质中HO-1的表达进一步上调。此外，在单独使用过氧化氢刺激的细胞中，HO-1的酶活性略有上调，但在使用CK预处理时更容易被激活（图4C）。而HO-1抑制剂ZnPP则明显抑制了其活性。
6.抑制HO-1活性则消除了CK对过氧化氢的细胞保护作用
我们进一步评估了CK在ARPE-19细胞中对过氧化氢的抑制活性是否依赖于nrf2介导的HO-1激活。如图5所示，当与CK和ZnPP联合使用时，CK对H2O2促进的ROS生成的抑制作用明显逆转。此外，ZnPP破坏了CK对细胞质释放细胞色素c的阻断作用，对Bax和Bcl-2的变化、caspase-3的激活和PARP的裂解的抑制作用也被抵消。此外，ZnPP的处理主要中和了CK对H2O2处理细胞的凋亡挽救作用，CK对细胞活力下降的抑制作用明显消失（图6）。
通过各种实验模型积累的数据表明，人参皂苷的代谢物CK通过清除ROS，可以有效地保护细胞免受氧化应激。例如，Kang等报道，CK可以通过阻断H2O2诱导的成骨细胞中ROS的生成来阻断关节软骨的降解。Li等也认为，CK通过阻断线粒体损伤引起的ROS积累来抑制心肌缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡。此外，以往的大量研究表明，CK抑制ROS水平在改善肾损害、缺血性卒中和动脉粥样硬化等方面具有重要作用。然而，CK在保护RPE细胞免受氧化损伤方面的作用尚未被研究。在目前的研究中，我们利用成熟的H2O2处理的氧化应激模拟ARPE-19细胞模型，基于抗氧化活性分析了CK对细胞损伤的抑制作用。
在RPE细胞中，由于自由基清除能力的降低和氧化还原平衡的破坏而导致的异常ROS的过量产生可能导致DNA损伤和细胞凋亡的激活。根据流式细胞术结果和DCF-DA染色的荧光图像分析，CK在非细胞毒性范围内显著抑制了过氧化氢处理的ARPE-19细胞中的ROS生成，这与改善细胞存活率有关。这些结果与过去使用不同细胞类型的研究结果一致，提示CK可能是一种氧化应激抑制剂。此外，与之前的研究一致，即CK能够通过减少UV特异性DNA损伤来保护角质形成细胞免于凋亡，CK可明显减弱H2O2刺激的DNA损伤和细胞凋亡。这些数据表明，CK对H2O2促进的ARPE-19细胞DNA损伤和凋亡的阻断作用与阻断ROS的产生直接相关。
ARPE-19细胞中氧化应激刺激的细胞死亡与线粒体功能的缺失直接相关。在这两种凋亡途径中，线粒体介导的凋亡的调控被归类为一种固有的凋亡信号通路，它高度依赖于Bcl-2家族蛋白的活性。其中，当Bax等凋亡促进蛋白的表达增加时，它会易位到线粒体，不像包括Bcl-2在内的细胞凋亡抑制蛋白。Bax在线粒体外膜上形成孔，诱导MMPs的分解，促进细胞色素c释放到细胞质中。细胞色素c在细胞质中触发caspase级联反应，最终终止细胞凋亡。在我们的研究中，Bax/Bcl-2比值之间的关系，表现为Bax的升高和Bcl-2水平的降低，与未处理的细胞相比，H2O2刺激的ARPE-19细胞的结果被逆转。此外，我们观察到H2O2刺激细胞的细胞质中细胞色素c的表达增加，同时MMP丢失。然而，所有这些变化都被CK给药显著抵消，表明CK通过阻断ROS的产生来阻止H2O2诱导的线粒体损伤。
近年来，很多研究表明Nrf2是调节氧化应激相关视网膜变性的有效靶点。例如，已被证明发生在Nrf2缺陷的小鼠中amd样视网膜发生改变，表明Nrf2的负调控与黄斑病变的发生和进展有关。此外，我们发现Nrf2介导的HO-1激活通过防止RPE细胞的氧化损伤，在改善黄斑病变中发挥了重要作用。众所周知，Nrf2通常在无氧化应激条件下，通过与kelch样ech相关蛋白1（Keap1）的物理相互作用而被降解，这是Nrf2的阻断剂。然而，在氧化刺激或有Nrf2刺激因子存在的情况下，Nrf2与Keap1分离。此后，Nrf2必须被磷酸化，以启动细胞核中包括HO-1在内的第二期解毒酶的转录活性。在这方面，我们研究了Nrf2在CK抗氧化活性中的作用，并发现CK增强了Nrf2在H2O2刺激的ARPE-19细胞的细胞核中的表达和磷酸化。此外，CK上调了细胞质中HO-1的表达，并显著提高了其酶活性，表明CK激活了Nrf2调控的HO-1抗氧化信号通路。然而，当ZnPP阻断HO-1的活性时，CK清除ROS的活性明显减弱。此外，在ZnPP的存在下，CK对过氧化氢修饰凋亡调节蛋白表达的阻断作用被消除，，最终失去了CK提高细胞活力的能力和抑制细胞凋亡的作用。这些结果表明HO-1活性的增强有助于CK减轻对氧化应激诱导的细胞破坏的作用。此外，我们的研究结果很好地支持了先前的研究结果，即与氧化应激诱导的视网膜细胞损伤相关的眼病风险可通过激活HO-1来调节。因此，这些发现表明，CK至少可以通过Nrf2介导的HO-1激活，使ARPE-19细胞免受H2O2刺激的氧化损伤。然而，还需要进行进一步的研究，包括参与CK磷酸化Nrf2的细胞内信号通路的作用，及其在体内动物模型中的疗效。
综上所述，在目前的研究中，我们发现CK可以减轻H2O2刺激的RPE ARPE-19细胞中的DNA损伤、线粒体损伤和凋亡，同时阻断ROS的产生。CK还显著增强了HO-1的表达及其酶活性，以及Nrf2的磷酸化和转位到细胞核。然而，当HO-1的活性被阻断时，CK的这些有益作用就被消除了。综上所述，我们的研究结果提供了证据，表明CK作为一种ROS清除剂，可以通过激活Nrf2/HO-1轴来挽救RPE细胞免于氧化损伤，并可能防止氧化应激引起的视网膜损伤。
实验学习
JC-1染色检测线粒体膜电位（MMP）
原理：JC-1染料表现出电势依赖性的积聚在线粒体内。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光（Ex=585 nm, Em=590 nm）；不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC-1只能以单体的形式存在于胞浆中，产生绿色荧光（Ex=514 nm, Em=529 nm）。因此颜色的变化非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。线粒体的去极化程度也可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。
荧光观测和结果分析：检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，可以把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。注意：此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在最大激发波长和最大发射波长。如使用荧光显微镜观察，检测JC-1单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如观察GFP或FITC时的设置；检测JC-1聚合物时可以参考观察其它红色荧光，如碘化丙啶或Cy3时的设置。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。
生词学习积累
compound K (CK) 化合物K（CK）
ginseng saponin metabolite 人参皂苷代谢物
Ginsenosides 人参皂苷 皂苷类化合物
retinal pigment epithelial cells (RPE) 视网膜色素上皮细胞
Alleviate v. 减轻；缓解
Fluorescence analysis 荧光分析
reactive oxygen species (ROS) 活性氧（ROS）
Cytotoxicity 细胞毒性
mitochondrial impairment 线粒体损伤
Apoptosis [细胞]凋亡
nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) 核因子红系2相关因子2（Nrf2）
heme oxygenase-1 (HO-1) 血红素加氧酶1（HO-1）
zinc protoporphyrin 锌卟啉
Abrogate vt. 废除（法律等）；取消；去掉；抛开
Photoreceptors [生理] 光感受器
Choriocapillaris 脉络膜毛细血管层
Retina n. [解]视网膜
Edema n.水肿，浮肿，瘤腺体
Neovascularization n. 新血管形成，新血管化
oxygen consumption 氧消耗；耗氧量
Irreversible adj. 不可逆的；不能翻转的；不能倒置的；[法]不可取消的
age-related macular degeneration (AMD) 年龄相关性黄斑变性（AMD）
Ophthalmic adj. 眼的，眼科的
Saponin n. 皂角苷；皂素
genus Panax (ginseng) 人参属（人参）
Appreciable adj. 可预见的；可估计的；可察觉的；相当可观的
Scavenger n. 捡破烂的人，清扫工；清除剂
Antagonize 拮抗
umbilical vein endothelial cells 脐静脉内皮细胞
Cardiomyocyte 心肌细胞
Cisplatin [医]顺-二氯二氨络铂，顺铂，顺氯氨铂，氯氨铂
ischemic stroke 缺血性中风
hydrogen peroxide (H2O2) 过氧化氢
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