四倍体胚胎互补技术克隆小鼠

Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation

|核心内容：

为了评估供体细胞基因组的杂合性是否是克隆动物长期存活的关键参数，我们通过核移植的方法来测试了近交系或具有F(1)遗传背景的胚胎干细胞(ES)产生克隆小鼠的能力。

来自5个F(1)ES细胞系的克隆多数能存活到成年。相比之下，来自三个近交系ES细胞系的克隆总是在出生后不久因呼吸衰竭而死亡。

通过比较核克隆小鼠(完整的囊胚均来自单个ES细胞)和四倍体囊胚互补(只有几个注射的ES细胞形成内细胞团)，我们可以确定哪些表型取决于技术操作，哪些取决于ES细胞系本身的特性。

据报道，完全来自近亲交配的ES细胞注射到四倍体囊胚(ES细胞-四倍体)的小鼠的新生儿也会致死。与近交系克隆一样，来自近交系ES细胞系的ES细胞-四倍体幼崽在分娩后不久死亡，并有呼吸窘迫的迹象。相反，来自6个F(1)ES细胞系的大多数ES细胞四倍体新生儿发育成能生育的成年小鼠。

从近交系和F(1)ES细胞核获得的克隆幼鼠经常表现出胎盘和新生儿体重增加，而ES细胞四倍体幼鼠体重正常。无论是长期的体外培养还是一系列的基因打靶操作，F(1)ES细胞都可以产生活的、可育的成体。

我们得出结论，遗传杂合性是完全由ES细胞通过核克隆或四倍体胚胎互补获得的小鼠出生后存活的一个重要参数。此外，我们的结果表明，使用F(1)ES细胞进行四倍体胚胎互补是一种简单、有效的方法，可用于衍生具有复杂遗传改变的动物，而不需要嵌合中间体。

杂合性：

在自然种群中，杂合性是遗传变异研究的主要兴趣所在。它通常是数据集中的第一个“参数”之一。它可以告诉我们很多关于人口结构甚至进化历史的信息。高杂合度意味着存在大量的遗传变异。杂合度低意味着遗传变异性很小。通常，我们会将观察到的杂合度水平与我们在哈-温伯格平衡(HWE)下所期望的水平进行比较。如果观察到的杂合度低于预期，我们寻求将这种差异归因于近亲繁殖等方面。如果杂合度高于预期，我们可能会怀疑孤立破坏效应(两个先前隔离的种群的混合)。

杂合性丢失（loss of heterozygosity，LOH）：指两个成对等位基因发生不同的突变；常表现为丧失该基因的一个等位基因的部分或全部基因组序列。可怕的是，LOH一般与肿瘤的抑制基因（如p53）有关。在两个等位基因都存在时，生产出来的蛋白水平能够抑制恶性肿瘤的发生。而当一个等位基因明显异常或缺失时（另一个等位基因已经处于没有活性的状态），该蛋白合成减少，总蛋白量不足以发挥正常的抑制功能，细胞就转化为癌细胞。（另外一种对杂合性丢失的理解是，杂合子同源染色体上的等位基因，其中一个等位基因的部分或全部基因组序列常丢失，导致该等位基因不能表达，表现为未丧失的等位基因的纯合子性状。）

ES 细胞克隆显示新生儿出生率和胎盘重量增加：

这两只小鼠来自同一个胚胎干细胞系（F1.2-3）。左边是通过四倍体胚互补技术获得，右边通过核移植获得（克隆的新生儿和胎盘大小都急剧增加）

原文摘要：

To assess whether heterozygosity of the donor cell genome was a general parameter crucial for long-term survival of cloned animals, we tested the ability of embryonic stem (ES) cells with either an inbred or F1 genetic background to generate cloned mice by nuclear transfer. Most clones derived from five F1 ES cell lines survived to adulthood. In contrast, clones from three inbred ES cell lines invariably died shortly after birth due to respiratory failure. Comparison of mice derived from nuclear cloning, in which a complete blastocyst is derived from a single ES cell, and tetraploid blastocyst complementation, in which only the inner cell mass is formed from a few injected ES cells, allows us to determine which phenotypes depend on the technique or on the characteristics of the ES cell line. Neonatal lethality also has been reported in mice entirely derived from inbred ES cells that had been injected into tetraploid blastocysts (ES cell-tetraploids). Like inbred clones, ES cell-tetraploid pups derived from inbred ES cell lines died shortly after delivery with signs of respiratory distress. In contrast, most ES cell-tetraploid neonates, derived from six F1 ES cell lines, developed into fertile adults. Cloned pups obtained from both inbred and F1 ES cell nuclei frequently displayed increased placental and birth weights whereas ES cell-tetraploid pups were of normal weight. The potency of F1 ES cells to generate live, fertile adults was not lost after either long-term in vitro culture or serial gene targeting events. We conclude that genetic heterozygosity is a crucial parameter for postnatal survival of mice that are entirely derived from ES cells by either nuclear cloning or tetraploid embryo complementation. In addition, our results demonstrate that tetraploid embryo complementation using F1 ES cells represents a simple, efficient procedure for deriving animals with complex genetic alterations without the need for a chimeric intermediate.

参考文献：Eggan, K., Akutsu, H., Loring, J., Jackson-Grusby, L., Klemm, M., Rideout, W. M., … Jaenisch, R. (2001). Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proceedings of the National Academy of Sciences, 98(11), 6209–6214. doi:10.1073/pnas.101118898