Nat Cancer | KMT2C缺陷通过DNMT3A介导的表观遗传重编程促进小细胞肺癌的转移

导语

结果解读：

基因编辑的肺器官样本中的原发性小细胞肺癌模型

为了模拟人类小细胞肺癌（SCLC）的病理学，尤其是其大规模的远端转移，作者创建了一种策略，利用基因组编辑的肺器官样体在小鼠中生成原位和驱动基因定义的SCLC（图1a）。简而言之，作者从成年C57B/L6小鼠的肺组织中培养出器官样体，并引入Cas9和单导RNA（sgRNA）来破坏与人类SCLC相关的基因（扩展数据图1a, b）。一旦原位移植到同种移植体的肺部，sgTrp53; sgRb1; Myc; Cas9（PRM）肺器官样体在肺部形成一个病变，通过荧光素酶活体成像和微计算机断层扫描（微CT）进行监测（图1b, c）。活检显示一个具有特定绿色荧光蛋白（GFP）表达的单个病变，表明肿瘤来源于移植的器官样体，在注射部位（图1d）。与传统的基因工程小鼠肺癌模型中的众多病变相比，这些单个原发肿瘤精确地重现了通常由单个或有限数量的原发病变发展而来的人类疾病。这些病变主要由肿瘤细胞组成，细胞体积小，细胞质稀少，核染色质颗粒状，有频繁的有丝分裂，提示这些肿瘤是小细胞肺癌（图1e）。这些肿瘤细胞对TTF1和多种小细胞肺癌诊断标记物如ASCL1、SYP、CHGA和KI67呈阳性（图1f，gg和扩展数据图1c）。然而，它们对NEUROD1呈阴性反应，提示PRM肿瘤是经典的ASCL1-NE SCLC。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）揭示了转移轨迹

鉴于先前的报告表明全球染色质可及性在小细胞肺癌转移中起到作用，作者对来自同一只小鼠的原发病灶和肝转移的小细胞肺癌细胞进行了转座酶可及染色质高通量测序（ATAC-seq）的实验。结果显示，转移性肿瘤细胞的染色质开放度降低，这表明在小细胞肺癌转移中可能存在不同的机制（扩展数据图2a-c和补充表1）。

为了探索转移过程中的分子重编程，使用单细胞RNA测序评估了同一只小鼠的原发肿瘤和转移部位（肝脏）。通过表达传统标记基因来识别细胞群体（图2a，扩展数据图2d和补充表2）。虽然来自肺部的一些肿瘤细胞与来自肝脏的细胞交集，但也有一些特定于原发肿瘤的细胞，这表明并非所有原发肿瘤细胞具有相同的转移能力（图2b）。虽然许多小细胞肺癌标记物（如Chga，Ddc和Ncam1）广泛表达，但Ascl1在所有转移细胞和一部分特定于原发肿瘤的细胞中高度表达，而Neurod1主要在特定于原发肿瘤的小细胞肺癌细胞中表达（图2c和扩展数据图2e）。事实上，转移细胞中完全没有Neurod1 + 小细胞肺癌细胞（扩展数据图2f），这表明Ascl1 + 原发细胞可能具有更强的转移能力，并且是多个转移灶的起源细胞。

KMT2C缺陷与SCLC转移相关

鉴于小细胞肺癌（SCLC）转移过程中的全球染色体重塑和基因调控（扩展数据图2a-c），作者推测一些表观遗传调控基因在这一过程中可能发挥重要作用。在特异性模块1基因中，有九个表观遗传调控基因，它们在人类SCLC中经常发生突变；KMT2C（10%）是排名第一的，其次是NCOR2、DNMT3A和KDM5B（扩展数据图3a和补充表9）。基因集富集分析显示，多个组蛋白和DNA甲基化途径在转移性SCLC细胞中显著负富集（扩展数据图3b和补充表10）。在癌症基因组图谱（TCGA）队列中，KMT2C突变在7%的原发性SCLC样本中被检测到，但在27%的转移性样本中被检测到，并且一致地，17%的癌细胞系百科全书（CCLE）SCLC细胞系源自转移部位的细胞中含有KMT2C突变，而源自原发肿瘤的细胞中没有KMT2C突变（图3a）。此外，转移细胞中Kmt2c的表达水平在小鼠和人类中均显著低于原发细胞（图3b）。ATAC-seq显示Kmt2c基因座在转移细胞中关闭，与原发肿瘤相比，其表达水平降低（图3c和附表1）。KMT2C的表达水平与SCLC的转移基因特征呈显著负相关（图3d），低KMT2C表达与SCLC患者的预后不良相关（扩展数据图3c）。

KMT2C的丧失导致体外出现一种早期恶性细胞群体

为了研究KMT2C在小细胞肺癌（SCLC）中的潜在功能，作者将针对Kmt2c的sgRNA转导到带有Cas9的肺器官样体中。通过T7核酸酶（T7E）酶切实验证了Kmt2c的破坏（扩展数据图3h）。KMT2C的丧失显著促进了肺器官样体的生长（图3f）。在对照组随机序列（sgScr）的肺器官样体中，有三种上皮细胞，包括Trp63干细胞、Notch1前体细胞和Cyp2f2分化细胞（图3g，hh和附表12）。从Trp63干细胞到Notch1前体细胞再到Cyp2f2分化细胞可以绘制出一个分化轨迹。然而，在KMT2C缺失的肺器官样体中，分化轨迹减弱，而到Mki67群体的轨迹增强（图3g-i）。沿着分化轨迹，分化标记物如Notch1和Cyp2f2被上调（扩展数据图3i）。相反，来自人类的SCLC特征基因的表达沿着MKI67轨迹逐渐增加，沿着分化轨迹逐渐减少（扩展数据图... 3i和附表13）。来自SCLC患者的SCLC和转移标志物在MKI67轨迹上逐渐上调，在分化轨迹上逐渐下调（图3j）。这些分析表明，KMT2C的丧失本身会导致肺器官样体内的促转移状态。

KMT2C在小鼠中抑制小细胞肺癌的肿瘤发生和转移

为了在体内测试KMT2C在小细胞肺癌（SCLC）中的潜在作用，作者先前报道的方法中，利用短发夹RNA（shRNA）或CRISPR/Cas9抑制了Kmt2c，同时使用了Trp53和Rb1 sgRNA以及Myc过表达在原代肺器官样体（PRMK）中。与PRM器官样体相比，具有shKmt2c或sgKmt2c的PRMK器官样体的大小和数量显著增加（图4a，b）。PRM和PRMK的癌前器官样体被移植到C57B/L6小鼠的左肺中。荧光素酶活体成像显示，具有shKmt2c或sgKmt2c器官样体的接受者小鼠的胸部中有明显更强的荧光素信号，而对照组PRM小鼠的胸部中则较弱（图4c，d）。所有接受sgKmt2c器官样体的小鼠都在较短的潜伏期（69天）内死于SCLC，而对照组PRM接受者的潜伏期为126天（图4e）。同样，所有接受shKmt2c器官样体的小鼠都发展出SCLC，并且潜伏期显著缩短（93天；图4e）。所有KMT2C缺失的肿瘤都呈现出与人类SCLC相似的病理特征，TTF1染色强烈（扩展数据图4a）。PRMK肿瘤也对ASCL1、CHGA和SYP呈阳性，但对NEUROD1呈阴性，表明它们属于经典NE型小细胞肺癌（扩展数据图4b）。这些数据证明了Kmt2c在小细胞肺癌中是一个真正的肿瘤抑制因子。

与转移相关的表观遗传重编程

作为H3K4单甲基转移酶和二甲基转移酶，KMT2C的丧失降低了SCLC中H3K4me1和H3K4me2的总水平，这一点通过IHC染色和免疫印迹得到了证实，并且与RNA-seq揭示的PRMK肿瘤中Kmt2c的破坏一致（扩展数据图5a-c）。一致地，CUT&Tag测序显示，与PRM细胞相比，PRMK SCLC细胞中包括增强子和转录起始位点（TSS）区域在内的全局H3K4me1减少（图5a，扩展数据图6a，b和附表14）；在PRM转移性SCLC细胞中H3K4me1水平降低的基因中，93%的基因在PRMK细胞中也显示出显著降低的H3Kme1水平（图5b）。作者还观察到，基因组中H3K4me2水平，主要是在TSS区域，也受到了KMT2C丧失的下调影响（图5a，扩展数据图6c，d和附表15）。在PRM和PRMK细胞中，H3K4me3水平没有显著变化（图5a，扩展数据图6e，f和附表16）。然而，与PRM细胞相比，PRMK肿瘤细胞的全局染色质可及性降低（图5a，扩展数据图6g，h和附表17）。有趣的是，KMT2C缺失附近的染色质可及性总体上类似于转移性小细胞肺癌（SCLC），而PRMK肿瘤中染色质可及性较低的基因与PRM转移中的基因有显著交集（图5c）。这些数据表明，KMT2C缺失引起了显著的表观遗传重构，与转移性小细胞肺癌非常相似。

KMT2C丧失导致全局DNA低甲基化

作者注意到DNMT3A是一个模块1基因，并且在人类小细胞肺癌中经常发生突变（扩展数据图3a）。它也是106个基因中的一个，其H3K4me1水平显著降低，在转移性小细胞肺癌细胞中的染色质可及性和表达水平较原发肿瘤细胞低（扩展数据图8a）。KMT2C直接结合在Dnmt3a基因座的多个区域上，而KMT2C的丧失会降低结合和H3K4me1和H3K4me2水平。这些H3K4me1和H3K4me2结合位点与KMT2C结合位点交集（图6a）。在PRM转移性肿瘤细胞中，也观察到了KMT2C结合和相同区域H3K4me1水平的类似下降（图6a）。因此，Dnmt3a在转移过程中逐渐下调（图6b）。一致地，与没有转移的肺器官样体和人类小细胞肺癌相比，Kmt2c破坏显著抑制了Dnmt3a的表达（图6c）。在三个独立的小细胞肺癌队列中，DNMT3A的表达与KMT2C的表达显著正相关（扩展数据图8b），而DNMT3A的下调与小细胞肺癌患者的不良预后相关（扩展数据图8c）。这些数据表明，KMT2C可能通过组蛋白甲基化和染色质重塑直接调控DNMT3A的表达，从而抑制小细胞肺癌的转移。

KMT2C-DNMT3A-MEIS/HOX轴在小细胞肺癌转移中的作用

DNMT3A在白血病和非小细胞肺癌中已被证明是一个肿瘤抑制因子，但其在小细胞肺癌（SCLC）中的潜在功能，尤其是转移方面，尚不清楚。Dnmt3a的过表达导致PRMK肿瘤器官样体的数量显著减少，并减少了PRMK SCLC器官样体中轴突样突起的形成（图6h）。荧光成像显示，强制表达Dnmt3a减少了小鼠PRMK肿瘤的生长（图6i）。PRMK-Dnmt3a小鼠的肝转移灶数量明显少于PRMK小鼠（图6j）。Dnmt3a过表达还显著降低了SCLC小鼠外周血中的CTC频率（图6k，ll和附表24）。这些结果表明，DNMT3A缺陷是SCLC转移中KMT2C丧失的关键介导因子。

Dnmt3a的过表达增加了PRMK小细胞肺癌细胞中的DNA甲基化水平（扩展数据图9j）。Meis2是在小鼠和人类SCLC转移和肿瘤中与KMT2C缺失显著降低DNA甲基化的常见基因之一（图7a, b），并且是KMT2C缺失的SCLC中上调基因的前几名之一，其染色质可及性增加（扩展数据图7b, g）。MEIS2是Hox基因的主要调控因子和共转录因子，多个Hox基因的启动子区域，包括Hoxb5和Hoxb7，在PRMK肿瘤中的甲基化水平显著低于PRM肿瘤（图7c），它们的表达在PRMK肿瘤中显著上调，与PRM肿瘤相比（图7d）。虽然在PRM SCLC器官样体中破坏Dnmt3a显著上调了Meis2和多个Hoxb基因的表达水平，但Dnmt3a的过表达在PRMK肿瘤器官样体中部分降低了表达水平（图7e, f）。

S-腺苷甲硫氨酸（SAM）治疗小细胞肺癌（SCLC）

鉴于KMT2C和DNMT3A缺陷在SCLC转移中的关键作用，可能是由于协同的组蛋白甲基化和DNA甲基化，作者寻找可以挽救这些表观遗传异常的治疗方法。由于在大多数SCLC中KMT2C和DNMT3A的杂合突变或转录抑制，作者提出SAM，组蛋白和DNA甲基转移酶的共同底物，可能是SCLC转移的概念验证抑制剂。SAM处理显著增加了PRMK SCLC细胞中的DNA 5mC水平以及H3K4me1和H3K4me2水平（扩展数据图10a，b）。SAM处理以剂量依赖的方式显著抑制了PRMK肿瘤器官样体的生长（图8a），并且SAM处理显著减少了这些器官样体中类轴突突起的形成（图8b，c）。

总结

作者的研究结果表明，促转移的组蛋白和DNA低甲基化可能为小细胞肺癌提供治疗选择。表观遗传药物，如5-氮杂胞苷、组蛋白去乙酰化酶抑制剂和EZH2抑制剂，已经被批准用于癌症治疗。S-腺苷甲硫氨酸是一种经批准的临床药物，用于治疗肝硬化、抑郁症、骨关节炎和其他综合征。使用S-腺苷甲硫氨酸，作为许多甲基转移酶的共同辅因子，可以增强H3K4和DNA甲基化，可能通过KMT2C（在没有纯合缺失的情况下）、DNMT3A和其他途径，从而削弱小细胞肺癌的转移能力。